肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种多效细胞因子,与其Ⅰ型或Ⅱ型受体结合后可激活有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶、核因子κ-B(NF-κB)等信号通路广泛参与细胞分化和凋亡,促进炎症反应和肿瘤发展等。TNF-α作为重要的免疫因子亦可通过直接刺激下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,增强交感神经系统活性、抑制海马神经功能、损伤长时程增强效应(LTP)、促进5-羟色胺的前体物质色氨酸的分解代谢等途径影响学习记忆功能与情绪反应。临床试验表明,TNF-α拮抗剂阿达木单抗(Adalimumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)等对自身免疫性疾病患者的疲劳及抑郁症状有明显的改善。术后认知功能障碍(POCD)患者记忆功能损伤与血浆TNF-α浓度急性升高密切联系。创伤性脑损伤(TBI)患者脑内TNF-α水平急性增加引起的继发性神经损伤以及神经元丢失等与患者记忆障碍密切相关。动物研究发现急性应激反应可致小鼠海马TNF-α水平迅速增加并引发小鼠记忆障碍,外周给予依那西普(TNF-α受体拮抗剂)可以明显改善小鼠记忆障碍。目前研究TNF-α对中枢学习记忆功能及情绪的影响主要采用多次给予TNF-α的造模方式,如多次给予TNF-α模拟慢性炎性反应状态可致小鼠出现焦虑及抑郁样行为并损伤小鼠条件恐惧记忆等,而单次给予TNF-α是否对认知及情绪产生影响仍不清楚。传统中药复方六味地黄汤由六味中药构成(熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻)。六味地黄苷糖(LW-AFC)则是本研究团队从六味地黄汤中提取获得的活性成分群,主要由多糖、寡糖和苷类等三个活性部位组成。目前已获临床批件,正在进行Ⅱ期临床试验。前期研究表明,LW-AFC可以改善应激所致的小鼠认知功能损伤、情绪障碍、改善阿尔茨海默病(AD)模型小鼠学习记忆功能等,并且恢复神经-免疫-内分泌(NIM)网络的平衡是LW-AFC改善小鼠认知损伤及情绪障碍的现代药理学基础。在NIM网络中免疫系统主要通过细胞因子网络调节神经系统功能,而LW-AFC对细胞因子网络中TNF-α急性升高引起小鼠的行为变化的调节作用尚不清楚。因此,本研究通过单次腹腔注射TNF-α模拟小鼠体内TNF-α水平迅速升高,观察其对小鼠空间学习记忆及焦虑样行为的影响,并从神经突触可塑性和神经元损伤的角度探讨TNF-α影响小鼠学习记忆及情绪行为的可能途径,在此基础上观察了 LW-AFC对TNF-α模型小鼠焦虑样行为的干预作用及可能作用途径。一、单次腹腔注射TNF-α对小鼠认知与焦虑样行为的影响1.单次腹腔注射TNF-α对小鼠空间记忆功能的影响1.1单次腹腔注射TNF-α对小鼠空间探索阶段的影响记忆过程由信息的获取、巩固及提取阶段组成,Morris水迷宫实验的定向航行阶段即训练阶段主要反映记忆的获取和巩固,空间探索阶段即测试阶段主要反映记忆的提取。结束5天正常训练的小鼠于第6天开始空间探索实验前1h腹腔注射0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg TNF-α,观察其空间探索行为的变化。实验结果表明,与对照组比较,腹腔注射TNF-α可使小鼠的逃避潜伏期明显延长,穿环次数明显减少,提示空间探索阶段腹腔注射TNF-α可致小鼠空间记忆提取功能明显受损。1.2单次腹腔注射TNF-α对小鼠空间定向航行阶段的影响为探讨TNF-α水平升高是否也会影响学习记忆的获取与巩固,采用Morris水迷宫实验,分别在定向航行的第1,3,5天开始行为学实验前1h腹腔注射0.2mg/kg TNF-α,观察TNF-α对实验小鼠空间定向航行阶段逃避潜伏期以及空间测试阶段穿过平台次数的影响。实验结果表明,与对照组比较,TNF-α腹腔注射对小鼠的逃避潜伏期和穿过平台的次数均未产生明显影响,提示TNF-α水平的升高对小鼠记忆的获取与巩固无明显影响。以上研究结果表明,TNF-α水平升高主要影响小鼠记忆的提取过程。2.单次腹腔注射TNF-α对小鼠焦虑样行为的影响为探讨TNF-α水平升高是否对小鼠焦虑样行为产生影响,首先采用高级十字迷宫实验,在实验前1h腹腔注射0.1、0.2、0.4mg/kg TNF-α,观察TNF-α对实验小鼠在高架十字迷宫的行为变化。实验结果表明,与对照组比较,给予TNF-α组小鼠进入开放臂/封闭臂次数、开闭臂总次数/总时间及进入开放臂次数占进入开闭臂总次数的百分比均无明显差异,在开放臂停留时间和在开放臂停留时间占在开闭臂总时间的百分比明显减少,在封闭臂时间明显增加,提示TNF-α水平升高可使小鼠产生焦虑样行为。接下来,采用旷场实验,在实验前1h腹腔注射0.1、0.2、0.4mg/kg TNF-α,观察TNF-α对实验小鼠在旷场中运动的总距离及在旷场中心区域探索时间的影响。实验结果表明,与对照组比较,给予TNF-α组小鼠在旷场中运动的总距离未产生明显影响,在旷场中心区域的探索时间有降低的趋势。以上研究结果表明,除学习记忆外TNF-α水平升高亦可引起小鼠表现出焦虑样行为。二、单次腹腔注射TNF-α对小鼠认知与焦虑样行为影响的可能途径1.单次腹腔注射TNF-α对小鼠突触可塑性的影响LTP是突触可塑性的重要表现形式,被认为是学习记忆的生理学基础,与情绪变化亦联系密切。为探讨TNF-α水平升高是否通过损伤LTP对小鼠的认知及焦虑样行为产生影响。采用在体小鼠LTP实验,在实验前1h腹腔注射0.1、0.2、0.4mg/kg TNF-α,观察TNF-α对实验小鼠海马DG区平均群峰电位的影响。实验结果表明,与对照组比较,0.2、0.4mg/kg的TNF-α组小鼠在给予高频刺激后,小鼠的平均群峰电位明显降低,提示TNF-α水平升高可引起小鼠LTP损伤。接下来为了探讨腹腔注射TNF-α不同时间后对小鼠LTP的影响,前述研究结果表明0.2mg/kg的TNF-α即可引起小鼠LTP损伤,因此分别在实验前1h、12h、24h、48h腹腔注射0.2mg/kg TNF-α,观察TNF-α对实验小鼠海马DG区平均群峰电位的影响。实验结果表明,与对照组比较,TNF-α腹腔注射1h、12h、24h后,小鼠平均群峰电位均明显降低,而48h后则恢复至接近正常水平,提示TNF-α水平的急性升高可引起小鼠LTP短暂的改变。以上研究结果表明,TNF-α水平升高可致小鼠LTP损伤,这可能与小鼠空间学习记忆功能障碍及出现焦虑样行为密切相关。2.单次腹腔注射TNF-α对小鼠海马等不同脑区神经元尼氏体数目的影响学习记忆过程及情绪反应伴有神经细胞和突触可塑性,接下来为探讨TNF-α急性升高是否通过损伤神经元对小鼠的认知及焦虑样行为产生影响。采用尼氏染色法对小鼠海马、皮层、杏仁核、前额叶联合皮层神经元尼氏体进行染色。前述研究结果表明,0.2mg/kg TNF-α腹腔注射1h即可造成小鼠空间学习记忆行为损伤、出现焦虑样行为、导致LTP产生障碍,因此观察了小鼠单次腹腔注射0.2mg/kg TNF-α 1h后对神经元尼氏体数目的影响。结果表明,与对照组相比,给予TNF-α组小鼠海马尼氏体数量明显减少,皮层、杏仁核、前额叶联合皮层中尼氏体的积分光密度(IOD)值无明显变化,提示腹腔注射TNF-α可损害海马神经元、导致神经元尼氏体数量明显减少,但对皮层、杏仁核及前额叶联合皮层神经元无明显影响。以上结果表明,TNF-α水平升高可致海马神经元明显损伤,这可能与小鼠空间学习记忆功能的损害、焦虑情绪的出现以及海马LTP损伤具有密切关系。三、LW-AFC对TNF-α模型小鼠焦虑样行为的干预作用及可能途径1.依那西普对TNF-α模型小鼠焦虑样行为的影响前期研究表明,恢复NIM网络的平衡是LW-AFC发挥药理学作用的基础,在NIM网络中免疫系统主要通过细胞因子网络调节神经系统功能,而LW-AFC对细胞因子网络中TNF-α急性升高引起小鼠焦虑样行为的调节作用尚不清楚。上述结果表明,TNF-α水平升高可致小鼠出现焦虑样情绪,接下来首先选用TNF-α受体拮抗剂依那西普探讨是否可以通过直接干预TNF-α来改善TNF-α模型小鼠的焦虑样行为,为LW-AFC影响TNF-α模型小鼠焦虑样行为的可能药理作用途径提供参考。为了探讨是否可以通过直接干预TNF-α来改善TNF-α模型小鼠的焦虑样行为。采用高架十字迷宫实验,选用TNF-α受体拮抗剂依那西普通分别在实验前3天连续腹腔注射2.5mg/kg依那西普和实验前1天侧脑室注射25mg/kg依那西普,观察依那西普不同给药方式对TNF-α模型小鼠在高架十字迷宫的行为变化。实验结果表明,与对照组比较,腹腔注射TNF-α组小鼠进入开放臂/封闭臂次数、开闭臂的总次数/总时间及进入开放臂次数占进入开闭臂总次数的百分比无显著差异,进入开放臂时间显著减少,进入封闭臂时间明显增加;与模型组比较,腹腔注射和侧脑室注射依那西普组小鼠进入开放臂/封闭臂次数、开闭臂的总次数/总时间及进入开放臂次数占进入开闭臂总次数的百分比无明显差异,进入开放臂时间、开放臂时间占开闭臂总时间百分比显著增加,进入封闭臂时间明显减少,提示无论外周还是中枢给予TNF-α受体拮抗剂均能改善TNF-α水平升高引起的小鼠情绪障碍。以上研究结果表明,采用TNF-α受体拮抗剂可以直接干预TNF-α来改善TNF-α水平升高引起小鼠出现的焦虑样行为。2.LW-AFC对TNF-α模型小鼠焦虑样行为的影响为了探讨LW-AFC对TNF-α模型小鼠焦虑样行为的影响及可能途径,采用高架十字迷宫实验,在实验前2周连续灌胃给予LW-AFC和实验前3天连续腹腔注射依那西普,观察LW-AFC对TNF-α模型小鼠在高架十字迷宫焦虑样行为的改善作用。实验结果表明,与对照组比较,给予TNF-α和依那西普对照组小鼠进入开放臂/封闭臂次数、开闭臂总次数/总时间无明显差异,腹腔注射TNF-α组小鼠在开放臂停留时间、进入开放臂次数占总次数的百分比及在开放臂时间占在开闭臂总时间的百分比显著减少,给予TNF-α组小鼠在封闭臂时间明显增加;与TNF-α模型组比较,预防给予依那西普及LW-AFC组小鼠进入开放臂/封闭臂次数、开闭臂总次数/总时间无明显差异,预防给予依那西普组小鼠进入开放臂次数占总次数百分比明显增加,预防给予LW-AFC和依那西普组小鼠进入开放臂次数和在开放臂时间占总时间的百分比明显增加,在封闭臂时间显著减少,提示预防给予LW-AFC可以改善模型小鼠出现的焦虑样行为。以上研究结果表明,LW-AFC可以改善TNF-α水平升高使小鼠产生的焦虑情绪,并且通过调节TNF-α与其受体结合可能是LW-AFC发挥药理作用的途径之一。3.LW-AFC对TNF-α模型小鼠海马等不同脑区神经元尼氏体数目的影响前述实验表明,TNF-α可损伤小鼠海马神经元,为了探讨LW-AFC是否可通过改善TNF-α模型小鼠神经元损伤来改善小鼠的焦虑样行为。采用尼氏染色实验方法,观察LW-AFC对模型小鼠神经元IOD值的变化。实验结果表明,与对照组比较,模型组小鼠海马尼氏体数量明显减少,皮层、杏仁核尼氏体IOD值有下降的趋势,而前额叶联合皮层中尼氏体的IOD值无明显变化;与TNF-α模型组比较,LW-AFC给药组海马神经元尼氏体IOD值明显增加,提示LW-AFC可以改善TNF-α水平升高所致的小鼠海马神经元损伤。以上研究结果表明,LW-AFC可以改善TNF-α水平升高所致的小鼠海马神经元损伤,这亦可能是LW-AFC改善模型小鼠焦虑情绪的途径之一。通过以上研究得到以下结论:1.TNF-α急性升高可致小鼠空间学习记忆功能障碍并表现出焦虑样行为2.TNF-α急性升高可致海马LTP及神经元损伤。3.LW-AFC对TNF-α模型小鼠焦虑情绪及神经元损伤具有一定的改善作用。