立题背景: 视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，约占儿童全身恶性肿瘤的4％，90％发生于3岁以前。据估计，每年全世界有5000例（其中包括美国250～300例）RB新病例被确诊，且近年来有上升趋势。其恶性程度高，部分病例双眼发病，对视力损害极大，并可危及生命。近年来，尽管RB的诊断和治疗较以前都有了很大的提高，但其发生的具体机理仍不明确，难以达到根治的目的。为了解决这些问题，研究者进行了大量的研究。与RB相关的许多动物模型主要是通过异种移植和转基因两种方式在前房、视网膜下或皮下接种瘤细胞实现的，这些动物模型的建立为探讨RB发生机理和治疗方法提供了良好的工具，然而这些肿瘤模型却面临着成瘤率低的困扰，其原因尚不清楚。因此，探讨裸鼠肿瘤模型成瘤率低的原因，并进一步阐明裸鼠对抗肿瘤生长的相关机理，具有重要意义。 肿瘤细胞能否在体内生长与机体的免疫状态密切相关。目前，肿瘤免疫已成为肿瘤研究领域的热点问题之一。机体免疫系统识别肿瘤细胞表面的肿瘤抗原产生免疫应答，引起效应细胞的激活和释放一系列效应分子，攻击和清除肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长，同时也可能造成自身机体组织的损伤。这一应答能否有效地产生，取决于肿瘤细胞抗原性的强弱和宿主的免疫功能，其中细胞免疫在机体与肿瘤细胞的相互作用中发挥主导作用。在免疫功能正常的机体中，T淋巴细胞通过特异性识别肿瘤细胞，激活相关细胞因子，发挥特异性杀伤作用，这一经典的免疫过程已被人们所共识。然而目前众多的肿瘤动物模型中使用的是裸小鼠，此鼠由于染色体等位基因发生突变引起先天性胸腺发育不足，体内缺乏成熟的T细胞，细胞免疫相对低下，推测特异性细胞免疫在裸鼠对抗肿瘤生长中不是决定性力量。但其内的前T细胞及非特异性免疫细胞正常，可能在排斥瘤细胞过程中发挥一定作用。近年来，机体的非特异性免疫细胞，特别是中性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞，在抗肿瘤中的作用及机制日益受到研究者的重视。在肿瘤的发生、发展过程中，NK细胞既可以通过“内识别”方式直接与肿瘤细胞发生作用，也可以在中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞的作用下被激活而发生抗肿瘤的作用，但相关的具体机制到目前为止仍然不清楚。阐明非特异性免疫细胞等在机体抗肿瘤中的作用，为进一步研究肿瘤发生机理和免疫治疗提供依据，是当前肿瘤免疫学研究领域迫切需要解决的问题。 研究目的: 观察SO—Rb50瘤细胞在裸小鼠体内早期分布和成瘤情况，并探讨裸小鼠对抗SO—Rb50瘤细胞生长的免疫学机制。 方法: 1.裸小鼠22只，经尾静脉接种SO—Rb50瘤细胞，其中4只裸小鼠接种的SO—Rb50瘤细胞经Dil染色标记，运用荧光显微镜和流式细胞仪检测检Dil标记的SO—Rb50瘤细胞在体内主要脏器的早期分布及含量。2只接种瘤细胞裸小鼠于第7天被处死，HE形态学观察各脏器有无病变形成。定期观察其余裸小鼠的健康状况及有无肿瘤形成，待其死亡时立即解剖，大体观察各器官组织有无肿瘤形成，并取肝、脾、肾、肺、眼球和脑等脏器分别行形态学观察，免疫组织化学法检测MPO，CD56，CD68，CD3，CD20和CD79的表达。空白对照裸小鼠4只，经尾静脉注射无菌磷酸盐缓冲液（PBS）0.1ml。 2.裸鼠10只经尾静脉接种SO—Rb50瘤细胞，在不同时间点处死，运用流式细胞仪检测CD4+T细胞，CD8+T细胞及NK细胞在不同脏器的含量。设空白对照裸小鼠2只。 结果: 1.裸鼠经尾静脉接种瘤细胞后，Dil标记的SO—Rb50细胞早期主要分布在肝；脾、肺和外周血中也有少许发现。术后第二天对各脏器行荧光显微镜检测，观察到肝脏平均每个视野（100×）Dil标记的SO—Rb50细胞数为124±44.7，明显高于脾27.5±12.92和肺3.75±1.5（P<0.05）；术后第二天流式细胞术检测显示Dil标记的SO—Rb50瘤细胞分布于肝、脾、肺和外周血，所占比例分别为12.44％、3.49％、0.26％和1.67％。 2.在接种瘤细胞后第7天处死的裸小鼠，肉眼见肝脏表面散在灰白色瘤细胞灶，常规苏木素—伊红染色（HE）染色见肝脏SO—Rb50瘤细胞成团分布，周围少许中性粒细胞浸润，其它脏器未见明显改变；空白对照裸小鼠未见明显改变。其他16只接种瘤细胞的裸小鼠先后出现体重显著下降，活动能力极差，仅1只发生皮下肿瘤，于72d死亡，HE切片及免疫组化证实为RB；15只于28d，30d，38d，44d，50d，54d和62d时相续死亡，脏器损伤均发生在肝脏，且改变基本一致。大体观察见肝脏色暗红，质地较硬，表面粗糙凹凸不平；HE切片见肝内大量中性粒细胞及部分淋巴细胞浸润，肝细胞水肿变性，部分坏死；免疫组织化学示MPO，CD56，CD68，CD3，CD20和CD79均有不同程度阳性表达，平均每个视野中性粒细胞所占比例为41.13％±4.10％，明显高于T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞（P<0.001）；另外，NK细胞每个视野所占比例为23.62％±2.82％，明显高于T细胞、B细胞和巨细胞（P<0.001）；而T细胞和B细胞每个视野分别为12.69％±2.68％、12.61％±2.99％（CD20）和14.70％±1.86％（CD79），两者之间无统计学差异，但均高于巨噬细胞的比例6.71％±1.25％（P<0.05）。 3.流式细胞术检测显示，接种SO—Rb50瘤细胞后裸小鼠NK细胞在肝脏内的含量显著高于其他脏器；肝脏和脾脏中NK细胞和CD8+T细胞以及外周血的NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞随时间的增加呈升高趋势。 结论: 将SO—Rb50瘤细胞注入裸小鼠尾静脉后，瘤细胞主要分布于肝脏，能诱导裸小鼠肝脏发生对瘤细胞排斥反应，以中性粒细胞和NK细胞为主的非特异性免疫细胞在裸小鼠抗肿瘤生长的整个过程中发挥重要作用；同时，这一过程激活了CD4+T细胞和CD8+T细胞经胸腺外途径发育成熟，参与裸小鼠机体对瘤细胞的后期反应。