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脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)是一类能在油水界面上催化三酯酰甘油水解为甘油和长链脂肪酸的酶类,可以催化酯水解、酯交换、酯合成等多种反应,并被广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等领域。来源于芽孢杆菌属的脂肪酶因其良好的耐热性和耐碱性而具有较高的研究和应用价值。然而在短时间内应用传统的诱变野生菌的方法筛选出具有某些特定性质的脂肪酶高产菌株是不现实的,所以用基因工程方法生产脂肪酶已成为必然。枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌,具有极强的蛋白质分泌能力,是研究蛋白质表达和分泌的良好系统。利用枯草芽孢杆菌信号肽引导外源蛋白质定位分泌到细胞特定区间,可提高外源蛋白质的可溶性,避免因包涵体复性带来的产物纯化等困难。然而,同一种蛋白质在不同信号肽的作用下,分泌效率往往相差甚远,有的甚至不能实现分泌。因此,研究信号肽与目的蛋白质结构之间的关系,可用以指导外源蛋白质分泌表达中信号肽的选择,进而为外源蛋白质的分泌表达研究奠定基础。本文以B. subtilis 168来源的脂肪酶A作为研究对象,构建了高效分泌表达载体pMA5△MCS-lipA,并转化枯草芽孢杆菌WB600,得到脂肪酶分泌表达重组菌株WB600(pMA5△MCS-lipA)。经20 h摇瓶发酵培养,分泌到胞外的脂肪酶活力达到最高,为7.64 U/mL,是出发菌株WB600最高酶活(0.02 U/mL)的382倍。对其生长特性和稳定性研究发现,该重组菌株生长速度和生长量与出发菌株WB600相当;分离稳定性很好,在无选择压力的情况下连续传100代,细胞仍98%带有质粒;结构稳定性研究表明重组菌株在无选择压力的情况下连续传60代,可正确表达lipA基因的重组菌株占总菌株数的76.5%;传到100代时,这一比值降到43.6%,但仍可满足工业生产的需要。为了研究不同信号肽对脂肪酶分泌效率的影响,本文还选取了AprE, LipB, WapA, WprA四种蛋白质的信号肽序列,替换pMA5△MCS-lipA中lipA基因信号肽序列,构建了一系列分泌表达载体。分别转化枯草芽孢杆菌WB600,得到重组菌株WB600(pMAaprE-lipA),WB600(pMAlipB-lipA), WB600(pMAwapA-lipA), WB600(pMAwprA-lipA)。各重组菌株发酵20 h后,脂肪酶分泌表达情况有显著差异。最高酶活分别达到0.55 U/mL,1.38 U/mL,0.18 U/mL和0.77 U/mL。分别以WB600(pMA5△MCS-lipA)和WB600作为阳性和阴性对照,结合各重组菌株胞内脂肪酶活力和SDS-PAGE分析发现,胞内有明显的蛋白质特异性条带,但胞内脂肪酶活力较低,由此推断更换信号肽后的重组菌株由于不能很好引导脂肪酶的分泌输出,使得目的蛋白质前体物质积累在细胞内。结果表明,不同信号肽对脂肪酶A在枯草芽孢杆菌中的分泌表达有显著影响,为进一步揭示不同信号肽对同一种蛋白质分泌表达效率的影响关系奠定了基础。