羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)是一类水解蛋白或多肽底物的金属蛋白酶,它作为一种重要的工具酶被应用于胰岛素等产品的加工。近年来,毕赤酵母表达系统发展迅速、应用广泛、高密度发酵技术成熟、生产过程简单、且利于规模化生产。本研究试图构建重组人CPB酶原的毕赤酵母表达系统,同时,建立较系统而规模化的发酵和纯化生产工艺,以得到高纯度、高活性的重组人CPB产品。本文将酶切得到的PCPB目的基因片段与pPIC9载体进行连接,得到重组质粒pPIC9-PCPB,再转入毕赤酵母GS115,构建重组人CPB酶原毕赤酵母表达菌株。将构建得到的菌株经活化后转接到BMGY摇瓶培养基中,在温度30℃,摇床转数200rpm条件下,每24h补加终体积1%的甲醇诱导,诱导72h后,筛选出表达量最高的重组人CPB酶原毕赤酵母表达菌株。优化得到重组人CPB酶原种子培养基:胰蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,甘油10g/L,磷酸二氢钾1.2g/L,十二水磷酸氢二钠2.2g/L,消泡剂25μl/L。在温度30℃、转数220rpm条件下培养24小时左右,重组人CPB酶原种子菌体OD600可以达到10～20。在19L发酵罐水平,优化得到重组人CPB酶原发酵工艺参数:进罐种子接种量1.5%,在温度25℃,pH6.0,菌体OD600为200左右时,以每三小时增加1.Oml/L.h的补料速率加入甲醇进行诱导,培养116～120小时后,重组人CPB酶原表达量可达800mg/L以上。采用IMAC亲和层析和Qff离子交换层析进行CPB酶原产物的纯化。优化得到重组人CPB酶原纯化工艺参数:保持上样前重组人CPB酶原样品pH值不变,选择20mM Tris+0.3M NaCl体系作为IMAC亲和层析缓冲体系;选择10mM/20 mM Tris+5mMNaCl作为Qff离子交换层析缓冲体系。重组人CPB纯度达到95%以上,优于国内报道的同产品的纯度(90%),重组人CPB酶比活达120U/mg以上。在500L发酵罐生产规模水平,按上述优化的发酵和纯化工艺进一步放大,重组人CPB酶表达量稳定且达到760mg/L以上,重组人CPB纯度达95%以上,酶比活达120 U/mg以上。本研究建立的重组人CPB生产工艺操作简单、重复性强、稳定性好,已达到规模化生产的水平。得到的重组人CPB酶已应用在胰岛素加工试生产,酶切收率可达35%以上。