目的：　　 周围神经长距离缺损的修复,一直是临床上较为棘手的难题。修复长距离神经缺损的基础是合适的神经移植物。随着科学研究的发展应用人工合成生物材料,如硅胶管、PGLA、PLLA等在修复神经再生中取得了相应的桥接神经的作用,但由于缺乏组织相容性、神经的天然结构和生长因子,难以达到理想的功能恢复。许多研究者发现脱细胞神经移植物在用于神经损伤的修复中优于其他人工制备的移植物,由于脱去了周围神经的细胞成分,保存了神经天然结构,具有较好的组织相容性,脱细胞神经移植物被认为是修复长距离神经缺损的良好的移植物。　　 近年来种子细胞移植被认为是促进周围神经再生的重要方法之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种成体干细胞,具有体外分离培养方便、自我增殖、增殖速度快并且具有多向分化的特征,可向骨、软骨、脂肪、肌肉、神经胶质细胞、神经元等分化。BMSCs还可以合成和分泌神经营养因子(neurotrophic factor,NF),包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、睫状节神经细胞营养因子(ciliary neurotrophic factors,CNTF)、胶质源性神经营养因子(glial cell linederived factor,GDNF)和基本成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等。许多研究证实BMSCs作为神经组织工程的种子细胞,能够成功修复中枢和周围神经损伤。　　 周围神经损伤后再生的影响因素主要有以下几个方面:(1)神经生长抑制因子阻止神经再生,如抑制因子硫酸软骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfateproteoglycans,CSPGs)具有抑制轴突生长的作用,它不仅存在于中枢神经内,在周围神经中也大量存在,广泛分布在周围神经鞘和神经间质内,在周围神经损伤后其表达显著上调,抑制轴突再生。而硫酸软骨素酶ABC(ChondroitinaseABC,ChABC)可以降解CSPGs上的葡糖胺聚糖(GAG)侧链,从而降解CSPGs。Zuo和Tatsuya等发现经ChABC处理脱细胞神经支架后,可以促进再生轴突通过神经和支架的吻合口,并能显著增加脱细胞神经支架内再生轴突的数量和生长长度。(2)促进神经生长的因子促进神经再生。周围神经损伤后,神经局部、中枢神经系统和肌肉的微环境会发生一系列复杂的改变,调节神经营养因子和某些肽类物质如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)等表达,进而对神经再生起一定的协同促进作用,这些促进神经生长的因子的表达变化与神经损伤后的再生过程密切相关。　　 周围神经损伤的修复和再生机理非常复杂,受许多因素的影响,许多实验证明单一治疗方法虽有助于轴突再生和功能恢复,但效果并不理想,联合治疗能克服多种抑制周围神经轴突再生的因素。因此,本实验选用大鼠脱细胞坐骨神经(acellular rat sciatic nerve,ARSN)提供适宜轴突生长的通路,ChABC降解ARSN中抑制轴突生长的因子CSPGs,再将具有分泌神经营养因子功能的种子细胞BMSCs植入ChABC处理的ARSN内,用来桥接神经缺损,检测术后神经再生和功能恢复的效果及再生组织中促进神经生长的因子的表达,探讨其修复神经再生机制,为周围神经损伤的治疗提供新的思路。　　 实验方法：　　 一、制备ChABC处理的ARSN及检测　　 采用化学萃取脱细胞方法制备大鼠ARSN,将ARSN浸泡在100μl PBS(2U/mlChABC),水浴16小时(37℃),制备ChABC处理的ARSN。免疫组织化学染色观察神经支架内层粘连蛋白(laminin,LN)和CSPGs蛋白表达,扫描电镜观察神经支架基底膜结构,皮下埋置实验和CD3免疫组化染色检测神经支架的免疫相容性。　　 二、构建BMSCs复合ChABC处理的ARSN神经移植体　　 体外培养扩增BMSCs,传至三代,分别在成骨诱导培养液和成脂肪诱导培养液中进行培养,茜草素红染色和油红0染色鉴定。PKH26标记BMSCs,将标记的BMSCs(2×107/ml)注入ChABC处理的ARSN后复合培养5d,倒置显微镜和扫描电镜观察BMSCs在支架内粘附情况。MTT法检测神经支架的细胞毒性。荧光显微镜观察支架内PKH26标记的BMSCs分布和存活情况。免疫荧光染色和实时荧光定量PCR分别检测神经移植体内NGF和BDNF蛋白及基因的表达。　　 三、实验动物分组　　 用ARSN组、ChABC组、BMSCs组、ChABC+BMSCs组的神经移植体桥接长10mm坐骨神经两断端问的缺损,术后8w取材。　　 四、评估神经再生情况　　 1、坐骨神经功能指数(SFI)检测。2、用电生理方法检测动作电位潜伏期、传导速度和波幅。3、胫前肌湿重比率测定。4、神经移植体检测:荧光显微镜追踪神经移植体内PKH-26标记的BMSCs;免疫荧光法检测神经移植体中NF-200、S100、GFAP、VEGF、CD34、NGF、BDNF的蛋白表达;实时荧光定量PCR检测神经移植体中NGF、BDNF mRNA的表达;甲苯胺蓝染色和透射电镜检测神经移植体中有髓神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度。5、免疫组化法检测患侧胫前肌和患侧L4脊髓前角内运动神经元VEGF、NGF、BDNF蛋白表达;实时荧光定量PCR检测患侧胫前肌和患侧L4脊髓内神经营养因子神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)、BDNF、CGRP、CNTF、bFGF、GDNF、NGF和VEGF mRNA表达;患侧胫前肌胆碱酯酶染色计数运动终板。6、L4～5脊神经节HRP逆行标记检测。7、患侧足掌皮肤触觉小体HE染色。　　 五、统计学分析　　 所得数据以采用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据以均值±标准差(-x±s)表示。对于正态分布数据,组间均数比较采用单因素方差分析检验;对于非正态分布数据,组间均数比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为具有显著性差异。　　 实验结果：　　 1、正常神经内CSPGs呈弱阳性表达,ARSN组CSPGs呈强阳性表达,而ChABC组支架CSPGs表达阴性,三组间差异显著。ChABC组术后4w、8w支架内CSPGs表达极少,同时间点显著低于ARSN组。LN表达在ChABC组、ARSN组和正常神经组间无显著性差异。扫描电镜观察可见ChABC组和ARSN组支架基底膜管结构保留完整。皮下埋置1w和2w,ChABC组和ARSN组支架内仅有少量的CD3阳性T淋巴细胞亚群的浸润,同时间点显著低于正常神经组。　　 2、在倒置显微镜下可见刚接种的BMSCs呈圆形,贴壁后为成纤维细胞样细胞,10d后能够达到90％融合。用茜草素红和油红0分别对向成骨细胞和脂肪细胞诱导的BMSCs进行染色发现各自向诱导的细胞分化,即有红色的骨基质的沉积和脂滴形成。MTT法检测1～7d期间,阴性对照组、BMSCs组和BMSCs+ChABC组细胞生长曲线趋势相似,BMSCs增殖明显,各时间点三组间OD值比较无差异。BMSCs和ChABC处理的ARSN复合培养5d后,倒置显微镜和扫描电镜观察BMSCs在ChABC处理的ARSN内粘附良好。BMSCs组和BMSCs+ChABC组支架内可见PKH26标记的红色的BMSCs均匀分布,BMSCs组和BMSCs+ChABC组神经移植体内均有NGF、BDNF蛋白和mRNA表达,二组间表达无显著差异,而ARSN组未见NGF和BDNF表达。　　 3、神经移植术后,与ARSN组比较,ChABC组、BMSCs组和ChABC+BMSCs组坐骨神经功能指数(SFI)增高,神经传导速度增快,波幅增大,胫前肌湿重增加,有髓神经纤维数目、髓鞘厚度、轴突直径和神经纤维数目增加,其中ChABC+BMSCs组作用更显著。ChABC+BMSCs组神经移植体中段PKH26标记细胞数高于BMSCs组。　　 4、与ARSN组比较,ChABC组术后4w和8w神经移植体内神经纤维数目显著增加。　　 5、ChABC+BMSCs组和BMSCs组神经移植体内S100、GFAP、VEGF、CD34、NGF、BDNF的蛋白表达均显著高于ChABC组和ARSN组。　　 6、ChABC+BMSCs组和BMSCs组患侧L4脊髓前角内BDNF蛋白表达较ChABC组和ARSN组显著增加,ChABC+BMSCs组VEGF蛋白表达高于其他三组,NGF蛋白表达在各组间无显著差异。实时荧光定量PCR检测患侧L4脊髓内NF mRNA表达情况,与ARSN组和ChABC组比较,BMSCs组和ChABC+BMSCs组BDNF、CGRP、CNTF和NT-3mRNA相对表达增高,ChABC+BMSCs组VEGF mRNA相对表达高于其他三组,而bFGF、GDNF和NGF mRNA相对表达在各组间无显著差异。　　 7、ChABC+BMSCs组和BMSCs组患侧胫前肌BDNF蛋白表达较ARSN组和ChABC组显著增加,ChABC+BMSCs组VEGF蛋白表达高于其他三组,NGF蛋白表达在各组间无显著差异。Realtime PCR检测患侧胫前肌中NF表达情况,与ARSN组和ChABC组比较,BMSCs组和ChABC+BMSCs组患侧胫前肌内BDNF、CGRP、CNTF、NT-3 mRNA相对表达增高,ChABC+BMSCs组VEGF mRNA相对表达高于其它三组。bFGF、GDNF、NGF mRNA相对表达在各组间无显著差异　　 8、各组患侧胫前肌可见重新形成的运动终板结构;HRP逆行标记可见后根神经节内棕色标记的感觉神经元;足底皮肤可见触觉小体。与ARSN组比较,ChABC组、BMSCs组和ChABC+BMSCs组运动终板、感觉神经元和触觉小体的数量增高。　　 结论：　　 1、ChABC治疗能有效降解ARSN中CSPGs,对ARSN基底膜结构没有影响,ChABC处理的ARSN有良好的免疫相容性　　 2、ChABC处理的ARSN对BMSCs无细胞毒性,有利于BMSCs的粘附、存活及NGF和BDNF的分泌。　　 3、ChABC治疗可增加轴突长入脱细胞神经支架的数量,促进神经支架内BMSCs的存活和增殖。　　 4、BMSCs促进脱细胞神经支架修复神经再生的机制可能与增加相应的脊髓和肌肉内BDNF、CGRP、CNTF、NT-3的表达有关。　　 5、BMSCs联合ChABC对脱细胞神经支架修复周围神经损伤具有协同促进作用。