棉花作为全球主要经济作物之一在我国广泛种植。棉纤维是棉花生产的主要产品,但是,人们对棉纤维发育的分子调控机理仍不完全清楚,有待深入探讨,而且利用转基因技术来改善棉纤维产量和品质是非常必要的。研究表明,许多转录因子对棉花纤维发育具有重要的调节作用,其中Basic helix-loop-helix/helix-loop-helix（bHLH/HLH）转录因子在棉花纤维伸长发育过程中可能起关键作用。本实验室在先前的研究中发现了一个调控棉花纤维伸长的相互拮抗bHLH/HLH系统:GhACE1蛋白形成同源二聚体与下游靶基因的启动子顺式元件组合,从而促进棉纤维伸长发育,而GhFP2通过与GhACE1相互作用来抑制GhACE1-DNA复合物的形成,从而抑制棉纤维伸长。我们通过酵母双杂交技术筛选到另外一个与GhFP2互作的bHLH转录因子—GhPRE6,随后对GhPRE6在棉纤维发育中的功能进行了研究。本文进一步完善了 GhACE1、GhFP2以及GhPRE6在调控棉纤维伸长的三拮抗系统,其主要研究结果如下:1、GhPRE6是一个在棉花纤维伸长期发挥功能的bHLH转录因子以pGBKT7-GhFP2蛋白为诱饵筛查棉花纤维的酵母双杂交cDNA文库,筛选获得一个GhbHLH/HLH蛋白—GhPRE6,进而通过一对一酵母双杂交实验进行了验证。此外,双分子荧光互补及体外pull-down实验进一步证实了 GhPRE6能够与GhFP2相互作用。对GhPRE6氨基酸序列进行同源比对发现,GhPRE6从第18位到77位氨基酸包含一个高度保守的HLH结构域,说明它是通过与其他蛋白相互作用来发挥功能的。双荧光素酶报告实验结果表明,GhPRE6可能在棉纤维伸长发育中发挥正调控作用。2、GhPRE6转录调控机制研究为了分析GhPRE6蛋白的功能,对其进行了亚细胞定位及组织表达模式的分析,结果发现,GhPRE6定位于细胞核,在棉花纤维伸长期优势表达。这些结果说明GhPRE6是一个在棉花纤维伸长期发挥转录调控作用的bHLH/HLH转录因子。通过转录激活检测发现GhPRE6蛋白不具有转录自激活活性。酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证了 GhPRE6能够形成同源二聚体,说明bHLH/HLH转录因子通过形成不同形式的复合体来发挥它的转录调控作用。3、在拟南芥中过量表达GhPRE6能够促进植株表皮毛伸长发育棉花纤维和拟南芥表皮毛有着相似的发育机制,都是由单细胞极性伸长而来,由于棉花生长周期较长,转化难度较大,我们先通过在拟南芥中异源表达该基因来探究其功能。对生长一周的转基因拟南芥幼苗进行表型分析发现,GhPRE6过量表达拟南芥下胚轴长度明显长于野生型,并且GhPRE6转基因拟南芥成苗的叶柄也明显比野生型要长,在显微镜下观察下胚轴和叶肉细胞形态发现,与野生型相比,细胞长度均显著增长。将生长4周的野生型和GhPRE6过量表达转基因拟南芥叶片上的表皮毛洗脱下来,用显微镜对其形态进行观察,并进行长度统计分析,结果表明GhPRE6过量表达拟南芥表皮毛长度与野生型相比均显著增长,但是具有四个分支的表皮毛数量与野生型相比无明显差异。这说明过量表达GhPRE6会促进拟南芥表皮毛的伸长。进一步RT-qPCR分析结果表明,GhPRE6是通过促进细胞伸长相关基因的表达来促进拟南芥表皮毛伸长的。4、GhPRE6转基因棉花植株的获得及初步分析为了探究GhPRE6在棉花纤维发育中的功能,我们构建了GhPRE6过量表达及RNAi敲降载体,并通过农杆菌介导的遗传转化法获得了一些棉花植株。目前GhPRE6-OE已经得到了45个不同的株系,GhPRE6-RNAi也有5个株系,还有CB4以及CB5固体培养基上胚性愈伤组织也正在陆续出苗,有待进行表型分析。