背景及目的心血管病是导致人类死亡的首要病因。美国心血管病协会的的调查显示：2010年全年,因心血管病导致的死亡人数占北美所有死亡人数的31.9%,并且每年因心血管病需要进行外科手术的患者约800万例。膨体聚四氟乙烯是一种具有良好生物相容性的血管材料,由其制备的人工血管广泛应用于直径大于6mm的血管置换手术,但是当血管的直径小于6mm时,膨体聚四氟乙烯血管的通畅率就降的非常低。主要因为急性期的血栓栓塞和远期的内膜增生导致血管的堵塞。所以,自体血管,包括自体动脉和静脉仍然是小血管置换手术中的“金标准”选择。但是,并不是所有的患者都有可以应用的,质量良好的自体血管；并且选用自体血管作为桥血管的手术,手术效果受血管的质量影响较大,在极端的情况下,曾行血管置换手术的患者,面临无血管可用的困境。丝素蛋白具有良好的生物相容性,降解和吸收的速度较慢,并且降解后的产物无毒,不容易引起过敏反应。更为重要的是,如果在丝素蛋白上进行磺酸化处理,那么得到的材料就会具有抗凝的作用。抗凝作用的强弱与在其上面引入的磺酸基数量呈正相关。低温等离子体技术是进行材料表面改性的常用方法,该技术的优点有,它可以在改变材料表面性质的同时,不对材料的内部结构带来损伤。为了能够制备一种可以在临床上应用于冠脉搭桥手术的小口径人工血管,本研究经过不断的探索,构建了一种等离子体磺酸化丝素蛋白膜膨体聚四氟乙烯复合小口径人工血管。课题研究中选择了内径为4mm的膨体聚四氟乙烯小口径人工血管,先用氩等离子对该血管进行处理,然后利用丝素蛋白液涂覆处理后的膨体聚四氟乙烯血管内壁。待丝素蛋白液干燥后形成丝素蛋白膜结合于人工血管内壁,再用二氧化硫等离子体处理血管内壁,使丝素蛋白膜表面带上磺酸基团。之前的研究显示,该类血管在体外实验中表现出了良好的血液相容性。为了能够发明出可以应用于冠脉搭桥的小口径人工血管,本研究进行了内径4mm等离子体磺酸化丝素蛋白膜膨体聚四氟乙烯小口径人工血管的体内实验研究。本课题利用该复合小口径人工血管置换了新西兰大白兔的腹主动脉,并与市售的4mm膨体聚四氟乙烯血管相对比,以明确该复合小口径人工血管的通畅率是否优于普通的膨体聚四氟乙烯血管。材料和方法2.1、4mm等离子体磺酸化丝素蛋白膜膨体聚四氟乙烯复合小口径人工血管的制备取内径为4mm的膨体聚四氟乙烯血管,长度为6cm,垂直树立于等离子体机中,设定参数为：放电电压压强70Pa,放电功率60W,放电时间20min,处理气体为氩气。处理后立即用1.5mg/ml丝素蛋白溶液涂敷血管内壁,丝素蛋白由桑蚕茧中提取,选用的方法为盐析法。待丝素蛋白涂敷于膨体聚四氟乙烯血管内壁满意后,再次利用等离子体的方法处理丝素蛋白膜复合聚四氟乙烯血管,选用气体为二氧化硫。设定的参数为：流量:20SCCM;压力：20Pa；放电功率：60W；处理时间：20min。将处理后血管用环氧乙烷消毒,包装备用。制备好的血管内壁用扫描电镜检查,观察丝素蛋白膜的涂覆情况。血管表面元素分析用X射线光电子能谱仪(XPS)检测。2.2、小口径血管置换手术的兔实验模型建立实验选择22只新西兰大白兔为实验对象,随机分为两组,实验组12只,对照组10只。动物的饲养按照中华人民共和国和广东省的相关法律执行,实验方案由南方医科大学实验动物伦理委员会批准通过。将试验用兔称重,之后用1%戊巴比妥经兔耳缘静脉缓慢注入麻醉,剂量为30mg/kg,麻醉至兔心率降至160-180次/分,呼吸频率40-60次／分,兔对疼痛刺激无明显反应。将兔固定于实验台上,兔腹部皮肤备皮,用碘酒、酒精消毒兔腹部皮肤,选择腹部正中切口,位置于腹部中下1/3处,加用1%盐酸利多卡因局部浸润麻醉,依次切开腹部皮肤及腹白线,长度约4cm。用乳突撑开器撑开腹部切口。用温盐水纱布将周围肠道、膀胱推向腹部两侧及下方。暴露腹主动脉,结扎腹主动脉分支,同时经耳缘静脉注射肝素,剂量为3mg/kg,小心将腹主动脉与下腔静脉分离开。用游标卡尺测量腹主动脉外径,然后阻断分离的腹主动脉近、远端,于中部横断腹主动脉,于腹主动脉前壁做一长约3mm至4mm切口,用连续缝合的方法,用6-0Prolene线将小口径人工血管与腹主动脉近端吻合。同法将人工血管与腹主动脉远心端吻合。缝合远端最后一针时暂不打结,轻轻开放近心端血管阻断钳,排出人工血管内气体,然后夹闭近端阻断钳,开放远端阻断钳排除人工血管内气体。同时观察有无近端吻合口及远端吻合口出血。如无吻合口出血或出血量少,将远端吻合口处打结,然后开放远端血管阻断钳及近端血管阻断钳。如吻合口出血量大,用6-0 Prolene线加小块腹肌组织褥式缝合出血处,然后再次排气。伤口全面止血,满意后用4号丝线间断缝合关闭兔腹肌,用1号丝线间断缝合关闭兔腹部皮肤,伤口用酒精擦洗,无菌辅料覆盖,胶布固定。术中注意记录手术时间和主动脉的阻断时间。待兔清醒后送至单独兔笼内饲养。术后48小时给予青霉素预防感染,剂量为50000IU/kgo术后6小时开始给予阿司匹林抗聚治疗,剂量为3mg/kg。同时给予雷尼替丁抑制胃酸,剂量为5mg/kg,防止胃溃疡。术后第一天常规给予兔粮饲养。术后观察：观察腹部人工血管是否通畅。术后每天观察2次,主要观察有无兔双下肢瘫痪,有无下肢肌力增高,双下肢强直；于兔大腿内侧触摸股动脉搏动,波动良好可以判定腹主动脉通畅,波动差或无波动时需行腹主动脉B超检查,了解有无人工血管堵塞或狭窄。其次观察伤口、腹部有无出血,伤口有无感染迹象。术后每3日行腹主动脉B超检查一次,了解有无腹主动脉闭塞或狭窄。腹部伤口每2日换药一次,9天后拆线。兔出现腹主动堵塞后用戊巴比妥实施安乐死,剂量为120mg/kg。然后切开腹部取出人工血管标本。在存活的动物当中,获取标本的方法类似。获取标本后用生理盐水轻轻冲洗,然后在两侧吻合口处纵行切下部分标本,于中部横断切下部分标本,固定后送扫描电镜检查。观察术后3天,术后第4天至3个月,术后3个月内两组血管通畅率的情况,将两组对比。在分析第4天至3个月的通畅率时,剔除原本在3天内堵塞血管的数据,防止3天内栓塞的血管数量对之后的影响。内皮细胞的覆盖面积借助Metamorph软件,得出实验组和对照组血管在3个月时内皮细胞覆盖的血管内壁比例多少。统计方法：实验中的计量资料用均数±标准差的方式表达,行两样本的T检验,计数资料用卡方检验,P<0.05认为有统计学意义,选用SPSS13.0作为统计软件。结果3.1、材料、动物和手术中的基本情况扫描电镜检查提示对照组的膨体聚四氟乙烯血管表面可见聚四氟乙烯纤维,而实验组血管的内壁基本被丝素蛋白膜覆盖。手术中的两组兔的体重,手术时间,主动脉阻断时间,腹主动脉直径对比无明显差异,P值均大于0.05.3.2、血管通畅率实验组和对照组血管在术后3天,术后第4天至3个月,术后3个月的通畅率可以在相应的表格中看到。实验组术后3天的通畅率高于对照组(100%VS60%P<0.05),实验组在3天内未见血管的栓塞。超声检查可以明确血管通畅与否,并且超声的血流频谱检查可以测量血流的速度。但是在对照组,超声检查发现较多例数的血管内栓塞,血管内的血栓形成,血流频谱检查未见血流通过。在术后第4天至3个月和术后3个月的两个时间段内,实验组血管的通畅率均优于对照组,差异有统计学意义。血管置入3个月后扫描电镜检查提示：实验组血管内表面的内皮细胞生长和粘附较好,内皮细胞覆盖了血管内壁的84%面积,内皮细胞纵向生长,同时横向连接。但是在对照组,内皮细胞生长较差,覆盖的内壁面积约11%,对照组血管的内表面可见血小板激活,红细胞聚集,和细胞基质的沉积。结论总之,本研究通过改进了实验条件和参数,制备出了涂敷更满意的等离子体磺酸化丝素蛋白膜膨体聚四氟乙烯复合小口径人工血管。并利用兔制备了新的小口径血管置换手术的动物实验模型,该模型可以利用体征和超声检查及时、准确、方便的观察小血管通畅与否,值得推广。本课题利用该模型验证了内径4mm的等离子体磺酸化丝素蛋白膜膨体聚四氟乙烯复合小口径人工血管的通畅率。结果显示：该实验血管的通畅率优于普通的同内径的膨体聚四氟乙烯血管。可能的原因为磺酸化的丝素蛋白膜使实验组血管比对照组血管拥有更好的血液相容性和生物相容性。