不结球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensisMakino）又名小白菜、青菜，是我国南方长江中下游普遍种植的大众化蔬菜，在“菜篮子”工程中占有重要的地位。利用自交不亲和系进行杂交育种是不结球白菜等十字花科蔬菜作物杂种优势利用的主要方式。但是自交不亲和系的繁殖和保持存在一定的困难，限制了自交不亲和杂种优势在芸薹属作物中的应用推广。此外，自交不亲和反应涉及植物细胞间的相互作用，构成了复杂的信号调控网络。本研究以不结球白菜品种‘矮脚黄’自交亲和系及自交不亲和系为材料，对自交不亲和反应前后雌蕊中的总蛋白进行分离和质谱鉴定，确定了可能的自交不亲和因子——衰老相关半胱氨酸蛋白酶（senescence-associatedcysteineprotease，SCP）。通过构建BcSCP的过量表达载体，对该基因进行了拟南芥的遗传转化;从不结球白菜雌蕊cDNA文库中筛选获得了SCP的互作蛋白，并对SCP及其互作蛋白的功能进行了分析。本研究不仅有助于阐明SCP在芸薹属自交不亲和中的调控机理，而且能够为提高相关作物的杂种优势利用提供依据，具有重要的理论价值和实践意义。主要研究结果如下:　　1.不结球白菜自交不亲和性的荧光显微分析　　本研究利用荧光显微镜观察不结球白菜自交亲和系和不亲和系蕾期及花期授粉后，柱头上的花粉萌发和花粉管生长状况。结果表明，自交亲和系植株蕾期和花期授粉后，花粉粒萌发正常，授粉后12h花粉管穿过花柱接近子房。而不亲和系植株花期授粉后2-12h，柱头出现明显胼胝质现象，只有极少数花粉粒能够萌发，而且生长的花粉管发育畸形，无法穿过乳突细胞壁;不亲和系蕾期授粉与亲和系的花期授粉结果类似。此外，喷施3％NaCl溶液能够显著提高自交不亲和不结球白菜的花粉萌发率，促进自交结种。田间亲和指数结果与之相符。　　2.不结球白菜自交不亲和比较蛋白组分析　　利用优化的不结球白菜雌蕊双向电泳技术体系，提取获得自交亲和系及自交不亲和系花期授粉后0h和2h的雌蕊总蛋白，共分离获得25个差异蛋白点。其中22个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOFMS）和肽质量指纹图谱(PMF)技术得到成功鉴定。根据KEGG数据库检索和相关文献进行功能分类，这22个蛋白点分别参与能量代谢（4个），蛋白合成（3个），光合作用（6个），应激与防御反应（5个），以及蛋白降解（4个）过程。其中，UDP-糖焦磷酸化酶可以通过蔗糖降解过程影响花粉萌发和生长;谷胱甘肽S转移酶与花粉育性有关;衰老相关半胱氨酸蛋白酶参与细胞程序性死亡，与自花花粉的识别有关。　　3.不结球白菜自交不亲和基因表达聚类分析　　对自花授粉后0、0.25、0.5、1、1.5、2、4以及6h后的雌蕊进行取样，检测24个自交不亲和相关基因在雌蕊中相应授粉时间的表达谱，并对相应授粉时间柱头上的花粉萌发和花粉管发育情况进行观察。结果显示具有相似功能的基因被聚成一类，SRK、SLG和ARC1等基因在不亲和授粉后表达上调。自花授粉0.5h后，不亲和系中大部分基因的表达趋势与亲和植株中的存在明显分化，与此同时，不亲和花粉的附着和萌发开始出现抑制。　　4.不结球白菜BcSCP基因的表达分析及拟南芥转化研究　　本研究以不结球白菜品种‘矮脚黄’自交不亲和系雌蕊cDNA为模板，克隆获得了SCP基因序列。BcSCP序列全长为1，077bp，编码359个氨基酸，含有信号肽(Met1-Glu23)、Inhibitor29(Ser59-Phe116)以及Pept_C1（Ala141-Va1359）结构域。该基因与甘蓝和甘蓝型油菜存在96％的相似性，与拟南芥Arabidopsisthaliana和Arabidopsislyrata的相似性为88％。荧光定量PCR显示BcSCP在自交不亲和授粉后表达水平显著提高。我们利用Gateway技术，构建了BcSCP基因的转基因载体，通过农杆菌蘸花法转化拟南芥植株，并进行除草剂筛选获得阳性苗。本研究获得的转基因拟南芥植株可用于BcSCP功能的进一步研究。　　5.不结球白菜BcSCP的互作蛋白筛选及验证　　本研究以不结球白菜品种‘矮脚黄’自交不亲和系雌蕊为材料，提取总RNA，构建雌蕊cDNA文库。利用酵母双杂交技术从中筛选获得了BcSCP的互作蛋白harpin-inducedprotein-like(HIP)、TRAF-likefamilyprotein(TRAF)、HistoneH3(H3)以及calmodulin-bindingprotein(CBP)。利用质粒共转化和双分子荧光互补技术对BcSCP与HIP、TRAF、H3和CBP之间的相互作用进行验证，激光共聚焦观察发现互作部位发生在细胞膜上。荧光定量PCR结果显示，HIP、TRAF、H3和CBP在自花授粉后不亲和雌蕊中的表达水平提高。