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部分红曲菌株可产生桔霉素(Citrinin),前人研究发现,桔霉素聚酮合酶基因pksCT前体m RNA可通过选择性剪接(alternative splicing,AS)产生两种m RNA(pksCTα和pksCTβ)来调控桔霉素合成量,但调控机制尚未清楚。本文以红色红曲菌M7(Monascus ruber 7)为研究对象,向红曲菌的培养基中添加适宜浓度放线菌酮研究无义介导m RNA降解途径(Nonsense-mediated m RNA decay)对pksCTα和pksCTβ降解水平。采用RNA干扰技术,构建具有发夹结构和反向双启动子结构的RNA干扰载体,借助根癌农杆菌介导红曲转化得到干扰pksCTα以及同时干扰pksCTα与pksCTβ的干扰菌株,对所得菌株进行桔霉素检测以及转录组分析。主要研究结果如下:1、放线菌酮对pksCTα和pksCTβ降解水平。放线菌酮对桔霉素基因的表达有明显的抑制作用。红曲菌生长的第4天至第12天,pksCTα和pksCTβ表达量的比例先上升后下降,发酵液桔霉素的含量呈现出先上升后下降的趋势,说明pksCTα和pksCTβ表达量与桔霉素的合成量有一定相关性。2、单独干扰pksCTα和同时干扰pksCTα和pksCTβ红曲菌突变菌株。采用RNA干扰技术,通过基因克隆技术构建发夹结构RNA(hairpin RNA)干扰表达载体,借助根癌农杆菌转化法表将达载体转入红曲菌M7实现异源表达,经过基因组验证和筛选,成功得到单独干扰pksCTα和同时干扰pksCTα和pksCTβ红曲菌突变菌株。3、单独干扰pksCTα和同时干扰pksCTα和pksCTβ红曲菌突变菌株转录组分析单独干扰pksCTα与同时干扰pksCTα和pksCTβ较M7可变剪接表达量均有不同程度的减少,说明RNA干扰可以明显减少两种m RNA pksCTα和pksCTβ转录量,构建得到的突变菌株桔霉素产量大大减少。经差异表达基因分析发现:单独干扰pksCTα样本组与M7对照组相比,影响乙二醛酶样结构域、短链脱氢酶、葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶、MFS(Major Facilitator Superfamily)蛋白表达的基因表达量显著增加,影响烯酰-(酰基载体蛋白)还原酶的基因表达量显著减少。而同时干扰pksCTα与pksCTβ样本组与M7对照组相比,影响乙二醛酶样结构域、短链脱氢酶、碳酸酐酶和烯酰-(酰基载体蛋白)还原酶的基因表达量显著增加。这些基因表达量的变化也会影响着桔霉素的生物合成。通过GO和KEGG通路分析,Seroid biosynthesis和Oxidative phosphorylation两个通路可能是造成单独干扰pksCTα和同时干扰pksCTα和pksCTβ红曲突变菌株桔霉素合成的影响因素。4、成功构建表达绿色荧光蛋白EGFP的M.ruber M7菌株采用基因克隆方法,将EGFP基因转入内含潮霉素抗性基因大肠杆菌与农杆菌穿梭质粒pCAMBIA3300中,借助根癌农杆菌转化法表将达载体转入红曲菌M7实现异源表达,经过基因组验证,筛选得到表达绿色荧光蛋白EGFP的M.ruber M7菌株,经超高效液相色谱检测该菌株发酵液桔霉素含量与M7桔霉素含量差值在3%以内,说明成功构建表达绿色荧光蛋白EGFP的M7菌株,为研究构建反向双启动子体系RNA干扰红曲菌桔霉素合成提供了良好的出发菌株。5、成功构建干扰绿色荧光蛋白表达菌株采用基因克隆的方法,将内含子2或外显子3作为间隔序列克隆至内含反向双启动子系统的质粒p Silent-Dual1(p SD1)中,再次将带有反向双启动子体系与间隔序列的基因克隆至内含新霉素抗性基因大肠杆菌与农杆菌穿梭质粒pCAMBIA3300中,经质粒验证与序列比对,成功得到干扰绿色荧光蛋白表达载体pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Intron2-Pgpd A和pCAMBIA3300-neo-PtrpC-EGFP-Exon3-Pgpd A。借助根癌农杆菌转化法表将达载体转入成功表达绿色荧光蛋白EGFP的M7菌株实现异源表达,经过基因组验证,筛选得到两种干扰绿色荧光蛋白表达红曲菌突变菌株。