背景骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。随着人口老龄化,骨质疏松患者不断增多,研究如何有效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假说”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。功能系统是在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉,并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳定。因此,功能系统只有在支持与储备系统的支持下,才能维持结构和功能的稳定,而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新的补充,机体就会出现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此,当骨代谢过程中出现负平衡后,如何有效增加筋膜支架中未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充,促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。脂肪组织是支持与储备系统中重要储备,其中分离出的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要细胞储备形式。脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明：脂肪源干细胞易分离培养；具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在特定的环境中可以诱导向成骨、成肝细胞、成心肌细胞、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化；具有低免疫原性和免疫调节功能。此外,与目前研究较多的骨髓干细胞相比,脂肪源干细胞来源更广,获得更加容易,并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此,通过增加机体未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。应用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,骨保护素分泌减少,甲状旁腺素的分泌增加,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加,骨形成减少,最终导致骨质疏松。蛋白质组指“一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质”,是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体,而不仅局限于一个或几个蛋白质。蛋白质组学可以从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。由于蛋白质的分子量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质,而双向电泳技术则同时利用这两个性质的差异来分离细胞中的总蛋白质,因此它的分离能力强大,可以快速准确的发现表达发生变化的蛋白质。为探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,及脂肪源干细胞成骨诱导中的蛋白质谱变化,本实验通过观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学方面的影响及蛋白质谱变化分析进行综合评价,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的1、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定,以判断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞；2、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功；3、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织微环境的影响；4、对成骨2周及3周的脂肪源干细胞进行蛋白质谱分析。5、为“筋膜学假说”中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治疗退行性和衰老性疾病”提供部分实验依据。方法1、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫,胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。传至第6代时,分别通过形态学、成脂与成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原CD49d、CD90、CDllb、CD29、CD45和CD106进行鉴定,判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、40只Wistar雌性大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型组(B组)、治疗组(C)和治疗对照组(D组)。B、C和D组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液8mg/kg,3次/周；A组分别给予颈背部皮下注射生理盐水0.8mL3次/周。12周后,将A组和B组处死取材,判断造模是否成功。3、待模型建立成功后,收集传至第6代的脂肪源干细胞,经尾静脉向C组大鼠每只注射脂肪源干细胞3×106个,D组大鼠每只注射生理盐水1mL,4周后处死取材。4、处死后取出右侧胫骨上1/3部分,矢状面剖开,固定后酒精逐级脱水,分别浸入浸液Ⅰ(甲基丙烯酸甲酯70mL+邻苯二甲酸二丁酯30mL)、浸液Ⅱ(浸液Ⅰ+过氧化苯甲酰1g)和浸液Ⅲ(浸液Ⅰ+过氧化苯甲酰2.5g)各2d,再用新鲜配制的浸液Ⅲ进行包埋。JungK重型切骨机连续切取6gm厚度切片,进行组织学观察(Gemisa染色)和类骨质观察(von Kossa染色)。测量区域为生长板下1mm至4mm范围内,采用Lecia QWin多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。具体参数包括骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)和单位骨小梁破骨细胞数(OC.N),均采用国际通用的公式进行计算。5、对诱导2周、3周及未诱导分化的脂肪源干细胞蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过银染显色,获取三组细胞的蛋白组学图谱,通过比较三组细胞的图谱,挖取差异表达的蛋白点,进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱肽质量指纹图分析和蛋白数据库信息检索。结果1、经光学显微镜观察,原代培养的ADSCs24h后大部分可贴壁,细胞呈圆形、多边形或者梭形。细胞长势良好,7d后可按1：3传代,之后每3d可传代一次。经换液传代至第6代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形。体外诱导可以向成脂、成骨分化。流式细胞术检测发现CD29和CD90呈强阳性,CD106呈弱阳性,CD11b、CD45和CD49d呈阴性。2、长期大剂量给予糖皮质激素后,与空白对照组比较,模型组大鼠骨小梁变细、变薄,骨小梁排列紊乱,骨小梁间出现断裂,间距增大,出现陷窝；骨小梁的数量、相对体积和厚度均显著降低,而骨小梁的分离度增高,单位骨小梁破骨细胞数增多(P<0.05)。3、异体移植脂肪源干细胞后,与模型组比较,治疗组大鼠骨小梁数目增多,骨小梁变厚变粗,骨小梁间出现连接,陷窝减少；骨小梁的数量、相当体积和厚度显著增加,而骨小梁分离度显著降低,单位骨小梁破骨细胞数减少(P<0.05)。4、相对于未分化组,成骨2周和成骨3周变化趋势大于2倍并且变化趋势一致的共54个点。其中成骨组上调12个蛋白,下调15个蛋白。结论1、支持与储备系统中含有脂肪源干细胞,并且这种干细胞是一种未分化的间充质干细胞；2、长期给予大剂量的糖皮质激素可以建立骨质疏松模型；3、诱导脂肪源干细胞向成骨分化,可以筛选出差异蛋白；4、对“筋膜学假说”中“通过动员筋膜结缔组织中储备的未分化干细胞可以治疗退行性疾病”提供了部分实验依据。综上所述,移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠有一定的治疗作用,能够促进骨形成,增加骨密度,改善骨生物力学性能,降低骨折发生率。本实验进一步提示在骨质疏松的研究中应该更加关注提高机体干细胞的数量和促进干细胞向成骨细胞分化及骨组织的形成方面,为临床上治疗骨质疏松提供了一种新的研究思路。