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食源性致病菌引起的疾病是我国食品安全和公共健康关注的焦点之一。沙门氏菌和志贺氏菌是两种常见的食源性致病菌,均属于肠杆菌科革兰氏阴性菌。两种菌在形态学和生化特性方面十分相似,常同时存在于乳制品、蔬菜沙拉和禽肉等食品中,引起食物中毒。沙门氏菌可导致肠胃炎、伤寒和副伤寒,志贺氏菌可引起痢疾。因此,建立一种快速、简便的可同时检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌的方法,对于及时检出致病菌和避免食物中毒具有重要的现实意义。本研究以沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌,将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术和荧光技术相结合,首次建立了同时检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌的双重实时荧光跨越式滚环等温扩增方法(Real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)。通过比对沙门氏菌和志贺氏菌基因组序列,选择同源性好、保守性高的沙门氏菌序列(GenBank No.ALFE01000410.1)和志贺氏菌序列(GenBank No.LC111517.1)设计 RF-SRCA 引物,经过多次引物筛选及优化获得的引物具有高度特异性。通过优化反应体系,分别建立了沙门氏菌和志贺氏菌的单重RF-SRCA反应体系。在单重RF-SRCA反应体系和反应条件的基础上进行双重RF-SRCA优化,最终确定双重RF-SRCA反应体系和反应条件为:dNTPs(0.63 mM),Mg2+(3.00 mM),2 μL 10 × ThermoPol Reaction Buffer,沙门氏菌正反向引物浓度各0.25 μM,志贺氏菌的正反向引物浓度各0.50μM,DNA模板添加量各1.00 μL(阴性不添加),Bst DNA聚合酶(8 U),EvaGreen(0.8μL),使用无菌去离子水将体系补足至20 μL。扩增反应程序为:62℃45个循环,每个循环1 min,每1 min收集一次荧光信号。扩增完成后,对其扩增产物进行熔解曲线分析,熔解程序为:95℃ 15 s,70℃ 1 min,以0.1℃/s速度升温至95℃,70℃开始收集荧光信号,绘制熔解曲线。根据两种产物熔解温度(Melting temperature,Tm)检测食品中沙门氏菌和志贺氏菌。用双重RF-SRCA最终体系进行特异性和灵敏度试验。共选择44株菌包括14株沙门氏菌,7株志贺氏菌,23株非目标菌进行特异性试验,无菌去离子水作为阴性对照。试验结果显示,沙门氏菌和志贺氏菌的RF-SRCA产物具有相对稳定的Tm值,且14株沙门氏菌的Tm值统一落在88.89～89.84℃之间,7株志贺氏菌的Tm值统一落在84.24～85.34℃之间,阴性对照和非目标菌未发生扩增。对沙门氏菌和志贺氏菌的DNA模板进行10倍梯度稀释,分别进行单重RF-SRCA和双重RF-SRCA灵敏度试验,并与双重实时荧光PCR(Real-time fluorescent PCR,RT-PCR)方法进行比较。结果显示,单重RF-SRCA体系检测沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度均为2 fg/μL。双重RF-SRCA同时检测出沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度为20 fg/μL,双重RT-PCR的灵敏度为2 pg/μL。由此得出,双重RF-SRCA 比单重RF-SRCA检测灵敏度低10倍,但较双重RT-PCR的灵敏度要高100倍。在人工污染试验中,分别用沙门氏菌和志贺氏菌污染脱脂乳,用各稀释度菌液提取的DNA模板分别进行单重RF-SRCA、双重RF-SRCA和双重RT-PCR的检出限试验。结果显示,单重RF-SRCA检测沙门氏菌和志贺氏菌的检出限均为100 CFU/mL。双重RF-SRCA同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的检出限为101 CFU/mL,双重RT-PCR检出限为103 CFU/mL。结果表明,双重RF-SRCA的检出限较单重RF-SRCA的检出限高10倍,但较双重RT-PCR的检出限低100倍。实际样品检测中,将双重RF-SRCA方法与双重RT-PCR方法和国标方法进行比较。结果显示:62个样品中双重RF-SRCA方法、双重RT-PCR方法和国标法检测沙门氏菌的阳性检出率分别为9.7%、8.0%和6.5%,检测志贺氏菌的阳性检出率分别为 6.4%、4.8%和 3.2%。综上所述,本研究成功建立了双重RF-SRCA检测方法,实现了同时对食品中沙门氏菌和志贺氏菌快速、灵敏、高效的检测。该方法与双重RT-PCR方法相比,灵敏度更高,检出限更低。在实际样品检测中,双重RF-SRCA方法的阳性检出率均较双重RT-PCR方法和国标方法高。该方法操作简便,结果可直接判定,对食品中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测具有重要意义,为食品安全检测领域提供了新方法、新思路。