第一部分:动态监测小儿恶性肿瘤化疗患儿外周血MDR1、MRP、LRP的表达目的:探讨小儿实体恶性肿瘤化疗患儿外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中多药耐药基因(Multi-drug resistance1,MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(Multi-drug resistance-associated protein1,MRP)、肺耐药蛋白基因(Lung resistance protein,LRP)的表达量及其与临床化疗的关系。方法:经病理证实的肿瘤患儿59例,其中神经母细胞瘤组24例,卵黄囊瘤组16例,淋巴瘤组19例;30例健康儿童作对照组。应用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术,检测化疗患儿化疗前后外周血和手术切除新鲜冻存组织,以及对照组外周血中MDR 1、MRP、LRP的mRNA表达量;常规检测化疗患儿化疗前后相应肿瘤标志物的变化。运用统计学方法将化疗患儿化疗前与对照组外周血中MDR 1、MRP、LRP的mRNA表达量进行T检验;化疗患儿化疗前后外周血中MDR 1、MRP、LRP的mRNA表达量与手术切除肿瘤组织的MDR1、MRP、LRP的表达量、相应肿瘤标志物化疗前后的变化程度作相关性分析。结果:神经母细胞瘤组、卵黄囊瘤组化疗前MDR1的表达量明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);淋巴瘤组化疗前MDR1的表达量与对照组差异无统计学意义(P>0.05);所有化疗患儿外周血中MRP、LRP表达量化疗前与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。所有化疗患儿外周血MDR1表达量与同期手术切除的肿瘤组织MDR1表达量存在正相关( r = 0.894, P = 0.000);化疗前外周血MDR1表达量与首次化疗后相应肿瘤标志物变化大小的关系,神经母细胞瘤尿香草杏仁酸(VMA)(r = -0.440, P = 0.046),卵黄囊瘤甲胎蛋白(AFP)(r = -0.831, P = 0.000),淋巴瘤乳酸脱氢酶(LDH)(r = -0.495, P = 0.031)。化疗患儿随着化疗次数的增加MDR1表达量增加。结论:神经母细胞瘤与卵黄囊瘤可能存在一定程度的原发耐药;外周血的MDR1表达及组织MDR1表达与化疗疗效有明显负相关;化疗可诱导各种恶性实体瘤患儿PBMCs中MDR1表达增加,对MRP、LRP影响不大;动态检测患儿化疗前后PBMCs中mdr1 mRNA水平对化疗疗效及预后判定有一定的参考作用。第二部分:神经母细胞瘤相关标志物的检测目的:探讨运用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)定量检测BCL-2基因mRNA在神经母细胞瘤(NB)的表达和运用ELISA方法检测神经母细胞瘤患儿外周血VEGF、NSE、SF的表达,及其与神经母细胞瘤发生、发展和预后的关系。方法:收集神经母细胞瘤患儿手术切除标本16例,―80℃保存,其中化疗前标本6例、化疗后标本8例、既有化疗前又有化疗后标本2例,并在设定时间采集患儿外周血,离心收集血浆―80℃保存。应用实时荧光定量PCR检测所有标本中BCL-2和N-MYC基因的mRNA表达情况,同时收集相应肿瘤标本的石蜡切片,进行免疫组化检测。运用ELISA方法检查神经母细胞瘤患儿外周中VEGF、NSE、SF的表达。采用Evans标准对神经母细胞瘤患儿进行临床分期,所有组织标本均进行Shimade分型。运用统计学方法比较Ⅰ~Ⅱ及ⅣS期与Ⅲ~Ⅳ期、F型与UF型、化疗前与化疗后神经母细胞瘤组织中BCL-2基因的mRNA表达量的大小及BCL-2蛋白表达阳性率的大小;分析BCL-2的表达与N-MYC基因和耐药基因表达的相关性;及化疗、手术前后外周血VEGF、NSE、SF的表达变化;BCL-2、VEGF、NSE、SF与神经母细胞瘤发生、发展、预后的关系。结果:实时荧光定量PCR检测的BCL-2基因mRNA在神经母细胞瘤组织中的表达量Ⅲ~Ⅳ期明显高于Ⅰ~Ⅱ及ⅣS期(P<0.05)、UF型明显高于F型(P<0.05)、化疗后高于化疗前的表达(P<0.05),免疫组化结果与PCR结果基本一致;BCL-2的表达与N-MYC的拷贝数呈明显正相关(P<0.05),与耐药基因的表达无明显相关(P>0.05);BCL-2、VEGF、NSE、SF的表达量与神经母细胞瘤患儿的预后呈负相关(P<0.05)。结论:BCL-2作为一种重要的凋亡调控基因,运用实时荧光定量PCR检测其在神经母细胞瘤中的表达量,可作为判断神经母细胞瘤生物学特性和预后的重要指标。VEGF、NSE、SF作为外周血中的肿瘤标志物,可作为化疗疗效监测及预后判断的重要指标。