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恶性胶质瘤是最为常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有侵袭播散的生物学特性。以手术切除为主放化疗为辅的综合治疗策略仅能有限延长中位生存期。研究发现胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)在恶性胶质瘤的发生、发展及复发的过程中发挥了重要作用。Notch通路活化可通过调控nestin等靶基因维持神经干细胞的表型。在恶性胶质瘤中,Notch通路对GSCs干性表型的维持也已被证明。胶质瘤干细胞干性表型的维持需要Notch通路的高度活化,而Notch通路的特点决定胶质瘤干细胞高表达Notch受体,低表达Notch配体。在恶性胶质瘤中,胶质瘤干细胞是如何维持这种Notch受体表达优势的状态呢?解聚素-金属蛋白酶12(a disintegrin and metalloprotease 12,ADAM 12)是一类属于ADAMs家族具有金属蛋白酶以及解聚素等多种功能的蛋白,可促进Notch通路配体DLL1胞外域的脱落。本课题旨在研究ADAM12与Notch通路的交互作用对胶质瘤干细胞自我更新能力的影响及相关机制,为针对胶质瘤干细胞的靶向治疗寻找新的靶点。课题研究分为以下三个部分:第一部分实验:ADAM12在不同级别胶质瘤组织中的表达。通过免疫组化实验观察ADAM12在不同级别胶质瘤组织中以及对照脑组织中的表达及分布特点;同时检测ADAM12与CD133、神经巢蛋白(nestin)以及Notch1在胶质母细胞瘤标本组织中是否具有共表达趋势;western blotting以及Real time-PCR检测以上组织中ADAM12在蛋白水平及mRNA水平的表达;通过免疫荧光双染技术观察在胶质母细胞瘤组织标本以及肿瘤细胞球中,ADAM12分别与CD133、nestin以及Notch1是否共表达。结果显示:ADAM12在对照脑组织中的表达呈阴性或弱阳性,在胶质瘤组织中表达呈阳性,阳性率与胶质瘤级别呈正相关;western blotting以及Real time-PCR结果与免疫组化结果一致;在胶质母细胞瘤组织标本中ADAM12、CD133、nestin以及Notch1均呈高表达;免疫荧光双染显示在组织标本及肿瘤细胞球中ADAM12分别与CD133、nestin及Notch1均呈现共表达趋势。第二部分实验:ADAM12在维持CD33+胶质瘤细胞自我更新能力中的作用。首先通过免疫磁珠筛选u87及u251胶质瘤细胞中cd133+细胞,并进行悬浮培养;采用shrna重组慢病毒转染技术敲低cd133+胶质瘤细胞adam12的基因表达,设计两条adam12干扰序列分别进行转染,干扰序列1组(shrna1-adam12)与干扰序列2组(shrna2-adam12),同时设空白对照组(shrna-c)。基于已建立的稳转细胞株进行以下实验:通过westernblotting检测各组细胞adam12的表达情况;采用神经肿瘤球形成实验观察分析不同处理组细胞的自我更新能力;通过westernblotting检测不同处理组细胞成球后cd133、nestin、gfap与tubb3的表达情况以及notch通路组分notch1、dll1以及hes1的蛋白表达量;采用realtime-pcr检测不同处理组细胞notch1、dll1以及hes1的mrna表达量;酶联免疫吸附实验检测不同处理组细胞培养基中的游离dll1。结果显示:慢病毒转染技术可显著下调u87及u251胶质瘤细胞adam12的mrna及蛋白的表达量;与shrna-c组相比,沉默adam12基因表达组细胞的成球能力明显降低,gfap与tubb3蛋白表达量上调,cd133与nestin的蛋白表达量分别下调,u251细胞系与u87细胞系结果趋势一致。与shrna-c组相比,shrna1-adam12组与shrna2-adam12组的hes1在mrna及蛋白水平均下降;notch1在mrna与蛋白水平均无明显变化;dll1在mrna水平表达量变化不明显,但是在蛋白水平表达量明显上调,培养基中脱落的dll1含量明显下降。第三部分实验:研究cd133+胶质瘤细胞中notch通路对adam12表达的调控作用。首先利用notch通路特异性抑制剂dapt抑制其活性,作为dapt组;采用慢病毒转染技术沉默notch1的基因表达,作为notch1基因表达沉默组(shrna-notch1),同时设置空白对照组(control),通过westernblotting及realtime-pcr检测不同处理组adam12表达量分别在蛋白和mrna水平的变化。结果显示:与空白对照组相比,dapt组与shrna-notch1组adam12的蛋白表达水平以及mrna水平均明显下调。结论:1.adam12在对照脑组织中低表达或不表达,在胶质瘤组织中呈高表达且与胶质瘤级别呈正相关,同时与胶质瘤干细胞相关标记物具有共表达趋势。2.沉默adam12基因表达抑制cd133+胶质瘤细胞自我更新能力。3.在cd133+胶质瘤细胞中,过表达的adam12通过促进dll1胞外域的脱落解除自身受体顺式抑制对于Notch通路的竞争性拮抗作用,促进Notch通路的激活。4.在CD133+胶质瘤细胞中,抑制Notch通路活性可以下调ADAM12的表达水平。5.ADAM12与Notch通路之间存在正反馈回路,促使Notch通路保持高度激活状态,最终维持胶质瘤干细胞的自我更新能力。6.ADAM12有望成为针对胶质瘤干细胞分子靶向治疗的药物靶点。