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副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,简称VP）,是一种革兰氏阴性人鱼共患致病菌。副溶血性弧菌食物中毒与进食含有该菌的食物有关,生食或食入未煮熟的海产品或腌制食品是其主要传播途径。随着海产品消费水平的提高,副溶血性弧菌引起的食物中毒事件呈逐年上升的趋势,由该菌引发的疾病现已跃居食源性疾病之首。锯缘青蟹呼长孤病毒是近年来发现的一种青蟹类病毒,其致死率较高并难以控制,严重影响了青蟹养殖业经济的发展。由于该病毒发现较晚,国内对其进行的研究相对较少。目前,针对副溶血性弧菌的检测技术众多,包括各种分子生物学和免疫学方法。对青蟹呼长孤病毒的检测主要有肉眼症状观察法、传统的组织切片及超薄切片技术,PCR以及其衍生技术。但迄今为止,现有的各种检测技术虽然可以实现高特异性和高灵敏度,但是一般对仪器设备的要求比较高,且需要有熟练的专业技术人员操作,很难应用于基层单位及在病害发生现场进行快速检测。因此,针对上述两种具有严重危害的海洋病原微生物,迫切需要建立一种简便快速、特异性强、灵敏度高且成本低的检测技术,以适用于基层单位和现场的日常监测。交叉引物恒温扩增（CPA）是近几年建立的一种新的恒温扩增技术,该方法在恒温条件下就可以实现对目的片段的大量扩增。将该扩增技术与免疫胶体金技术相结合可实现快速、直观的检测效果,且对设备的要求比较低,操作相对简单。免疫胶体金技术是以胶体金为示踪物,利用抗原抗体特异性结合的原理,实现对抗原或抗体的快速检测。该方法灵敏度高,且对仪器的依赖程度低,操作简单。本研究结合分子生物学和免疫胶体金技术,分别建立了针对副溶血性弧菌和青蟹呼长孤病毒的新型检测技术,主要研究结果如下:（1）CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立:以副溶血性弧菌种特异性溶血基因tlh为靶基因,设计两对扩增引物和一对检测探针。通过对CPA反应体系中的各个影响因子进行优化,最终确定最佳反应体系为:上下游外围引物各0.1μmol/mL,上下游交叉引物各0.6μmol/mL,两条检测探针各0.3μmol/mL,Mg2+浓度为4.0 mmol/mL,甜菜碱浓度0.8 mol/L,dNTPs浓度0.4 mmol/mL,2μl 10×ThermoPol缓冲液,反应温度63℃,反应时间1 h。分别采用核酸试纸条和琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,结果表明两种检测方法对CPA扩增产物的检测结果一致。通过比较普通PCR法与CPA-试纸条法对副溶血性弧菌纯培养物和基因组检测灵敏度发现,CPA-试纸条对纯培养物的检测限为5.8×102cfu/mL,对基因组的检测限为11.4 pg/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍。该方法从扩增到检测完成仅需75 min,为副溶血性弧菌的快速检测提供了一种更高效的技术支持。（2）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12原核表达体系的建立:以BL21/pET28a为表达载体构建重组表达质粒,通过对诱导表达条件的优化,表达后的重组蛋白量占总蛋白的83%,实现了重组蛋白VP12的高效表达。（3）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备:以纯化的VP12重组蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经Western blotting分析该抗体能特异性的识别VP12蛋白,通过间接ELSIA测定该抗体的效价为1:51200。（4）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备:以VP12重组蛋白为抗原进行单克隆抗体的制备,采用常规免疫技术,通过脾细胞与杂交瘤细胞的融合,成功制备了5株抗VP12细胞株。最后经Dot blotting分析,细胞株1M9和2N5产生的抗体亲和力较高,因此,选取McAb 1M9和McAb 2N5作为后续免疫胶体金制备的抗体材料。采用硫酸铵与protein G亲和层析法对单克隆抗体进行纯化,纯化后的抗体浓度分别为4.004mg/mL、4.078 mg/mL,且经SDS-PAGE电泳检测只有重链和轻链两条特异性条带。Western blotting实验结果表明抗体特异性较好,经间接ELISA测得两个抗体1M9和2N5的效价分别为1:102400和1:51200。（5）免疫胶体金试纸条的制备及其检测应用:采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金颗粒,对制备的胶体金进行透射电镜和紫外可见光谱分析,证明制备的胶体金颗粒均一、分布均匀,质量较好,可以用其标记抗体。用1M9抗体作为金标单克隆抗体,同时分别将2N5单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线。通过一系列优化最终确定金标抗体的最低标记浓度为37.5μL每毫升胶体金溶液,单克隆抗体2N5和羊抗鼠IgG的包被浓度均分别为0.75 mg/mL和1.0 mg/mL。在此基础上将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按顺序依次组装成一次性免疫胶体金层析试纸条。用试纸条分别对稀释后的VP12重组抗原和呼肠孤病毒颗粒进行检测。检测结果表明,该试纸条对纯抗原的检测灵敏度为3.8μg/mL,对病毒颗粒的检测灵敏度为20.4μg/mL。取对虾白班综合症病毒和无菌水作为阴性对照检测其特异性,结果显示该试纸条只对锯缘青蟹呼肠孤病毒的检测结果呈阳性,具有较好的特异性。本研究建立的针对两种病原微生物的检测方法,具有快速、灵敏、高效、直观的检测特点,为两种病原微生物的早期预防、检验检疫、快速诊断、监测防控提供了较为实用的检测工具。