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传统筛菌技术已不能达到现代实验目的,基于16S rDNA基因特定片段的扩增和测序分析,DGGE已成为研究微生物群落结构的重要技术之一。它已在各种自然生境的微生物群落组成研究中得到运用,解决了传统方法的片面性。本文立足于天津渤海湾溢油污染的生物修复问题,利用PCR-DGGE技术对原油降解菌群落结构进行初步研究。优化PCR-DGGE的实验条件,利用指纹图谱、条带测序、系统发育树分析对原油降解菌群落结构进行研究,为以后的相关研究提供基础的方法支持。采集天津渤海湾滩涂沉积物中,以原油为唯一碳源,富集的原油降解菌群用于PCR-DGGE实验。实验周期为2个月,7d取样一次,总8个样品。本研究依据不同的细菌DNA提取试剂盒对原油降解菌总DNA的提取效果,确定适用于本实验的试剂盒。通过对PCR体系中引物量、模板量和PCR程序中退火温度、循环数的优化,得到理想的PCR条件。同时也对DGGE实验条件中凝胶浓度、电泳电压与时间进行了优化,确定了DGGE条件。本研究结论如下:(1)在选用的细菌DNA提取试剂盒中,New Probe试剂盒提取样品的总DNA质量与纯度最优且满足后续实验要求,本研究选用New Probe试剂盒。(2)优化后的PCR条件为:扩增体系包括25μL Master、3μL DNA模板、1μL Primer-1、1μL Primer-2、20μLddH2O。扩增程序即:94℃预变性4min;94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,25个循环、72℃延伸6min。优化后的DGGE条件为凝胶浓度为8%、变性范围为30%-60%、电泳温度为60℃、电压和时间为60v,16h。(3)在实验周期内,根据原油降解菌的DGGE指纹图谱来分析,不同菌进入新环境之后适应时间存在一定差异,但是整体上原油降解菌群的群落结构相对比较稳定,没有出现明显的减弱趋势。(4)由测序结果可知,在群落结构中α变形菌较多。其中玫瑰杆菌属(Roseobacter.sp.)、节杆菌属(Arthrobacter.sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、微球菌属(Microbacterium sp.)均是常见的原油降解菌属。