背景与目的：　　临床上，磁共振成像（MRI）广泛用于对疾病的诊断、分期、随访及预后；在分子影像学领域，MRI因为空间分辨率高，软组织对比度好以及无辐射损伤等优势具有较大应用潜力，尤其适用于对移植细胞示踪的研究。MRI主要通过磁标记成像和报告基因成像两种方式实现对移植细胞的示踪，前者采用MRI对比剂如金属螯合物或者超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）直接标记细胞。由于SPIO横向弛豫率高，目前在细胞示踪成像上应用广泛。但是，这种利用MRI对比剂直接标记细胞的方法，存在一个很大的缺陷，即对比剂会随着细胞的分裂增殖逐渐降解，因而无法对移植细胞进行长期示踪。磁共振报告基因成像借助报告基因在细胞内持续稳定表达，能够克服上述磁标记成像存在的缺陷，很大程度上可实现对移植细胞的长期活体示踪。　　目前用于MR显像的报告基因有多种，如β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、转铁蛋白受体、MagA和铁蛋白等。在众多的MRI报告基因中，铁蛋白基因作为一种内源性报告基因近年来备受关注。铁蛋白为一种储铁蛋白，有重链和轻链两种亚基。其中，铁蛋白重链多肽1（FTH1）具有亚铁氧化酶的活性，可以促进铁的氧化和掺入，作为一种功能性磁共振报告基因已成为分子影像学研究的热点。　　然而，FTH1作为MRI报告基因的安全性是值得考虑的。目前，对FTH1表达对细胞有无影响的研究结果不完全一致。一些研究证明FTH1是一种抗凋亡基因，它可以增加细胞或组织对抗氧化应激的能力。然而，也有报告指出，在某些特定的细胞如宫颈癌Hela细胞、鼻咽癌细胞中，FTH1的过表达会明显降低细胞的增殖活性。此外，FTH1长期持续表达还会引发铁代谢紊乱。虽然铁是新陈代谢中多种生物活性酶的重要辅助因子，然而，过多的铁会诱发大量活性氧自由基产生，从而导致细胞的损伤或凋亡。　　基于以上研究结果，为了尽量减少FTH1持续表达并聚铁带来的不利影响，有必要对 FTH1的表达水平和表达时间进行精确调控，使其在需要MR成像时表达，不需要MR成像时关闭。四环素（Tet）诱导基因表达系统是一种常用的基因调控系统，它利用四环素或其衍生物强力霉素（Dox）可在转录水平特异性地控制基因表达。　　本实验结合 MRI报告基因成像和四环素基因表达调控系统的优势，通过构建 Tet-on可诱导 FTH1基因表达的慢病毒载体，将 FTH1基因稳定、高效地转入人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）中，探究MRI检测转基因细胞移植物中 FTH1诱导表达的可行性，旨在为细胞移植示踪提供一种可调控的、安全的MRI报告基因成像方法。　　方法：　　1 Tet-on可诱导FTH1基因表达的慢病毒载体构建及病毒包装　　应用PCR扩增FTH1基因，并将其插入Tet-on可诱导基因表达慢病毒载体（pLenti-Tet-on-MCS-3Flag-Puro）多克隆位点内，通过 PCR及DNA测序鉴定重组慢病毒载体（pLenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro）是否构建成功。接着在脂质体2000介导下将 pLenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293 T细胞，收集慢病毒，采用 ELISA法测定病毒滴度。将获得的慢病毒命名为Lenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro。　　2强力霉素诱导FTH1在人神经母细胞瘤细胞中的表达　　慢病毒Lenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro感染SK-N-SH细胞后，先加入嘌呤霉素（8μg/ml）筛选7 d，再加入嘌呤霉素（4μg/ml）筛选3 d即获得可诱导表达 FTH1的 SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞。将未感染慢病毒的SK-N-SH细胞作为阴性对照。　　通过免疫印迹和免疫荧光的方法半定量和动态评价 FTH1在SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞中的表达情况。采用3.0 T MR扫描检测SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞在FTH1基因表达和基因沉默状态下信号变化。应用CCK-8试剂检测SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞在高表达FTH1和添加FAC培养后增殖活性的变化。最后，采用普鲁士蓝染色和透射电镜检测SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞高表达FTH1后的聚铁情况。　　3 MRI检测SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞移植物中FTH1的诱导表达　　健康雄性裸鼠（nude mice），6～8 w龄，20～25 g。将处于对数生长期的SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞分别种植在裸鼠左右后肢根部皮下，约14 d后肿瘤直径为0.5～1 cm。　　随机挑选一只荷瘤裸鼠，在其饮水中加入1 mg/ml Dox和5 mg/ml FAC，分别在0、3、5 d、、、、、、行3.0 T MR扫描，观察到信号明显变化后，撤除Dox和FAC，恢复裸鼠正常饮水7 d，再次MR扫描，检测信号动态变化。　　将荷瘤裸鼠随机分为6组，分别在其饮水中加入不同浓度（0、0.5、1、2、4、6 mg/ml）Dox和5 mg/ml FAC，喂养5 d。3.0 T MR扫描并测定每组裸鼠双侧肿瘤组织的横向弛豫率 R2值，统计分析得出引起MRI信号明显改变的Dox浓度，即最佳Dox浓度。　　另外，再需要2组荷瘤裸鼠，1组不做任何处理（None：no Dox and no FAC）作为阴性对照；另1组仅向裸鼠饮水中加入最佳浓度的Dox，喂养5 d，行3.0 T MR扫描。　　扫描结束后，将3组裸鼠（None：no Dox and no FAC；FAC：no Dox and5 mg/ml FAC；Dox/FAC：2 mg/ml Dox and5 mg/ml FAC）双侧肿瘤组织取下，行普鲁士蓝染色、透射电镜观察组织聚铁情况；行苏木素-伊红（HE）染色观察组织在高表达FTH1和聚铁后有无明显病理改变。　　结果：　　1 Tet-on可诱导FTH1基因表达的慢病毒载体鉴定、病毒包装和滴度测定　　利用基因重组技术、PCR及DNA测序证实已成功构建Tet-on可诱导FTH1基因表达的重组慢病毒载体（pLenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro），继而进行慢病毒包装，获得病毒滴度约为1×109TU/ml，满足实验要求。2 SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞中FTH1基因的诱导表达及聚铁能力　　Western blot结果显示，FTH1诱导表达量与Dox作用浓度及作用时间呈明显依赖关系。0.6μg/ml Dox作用72 h后，FTH1的表达量达到峰值。同时，通过免疫荧光检测标签蛋白flag的诱导表达情况，两者结果一致。　　3.0 T MR扫描显示，SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞高表达FTH1并添加500μM FAC培养72 h后，R2值明显升高。细胞增殖活性检测结果显示，感染慢病毒及高表达FTH1对SK-N-SH细胞的增殖活性无明显影响；但是，无论有无FTH1表达，相对高浓度(500μM)的FAC均会降低细胞增殖活性（P＜0.05），且高表达FTH1的SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞增殖能力降低更明显（P＜0.05）。普鲁士蓝染色及透射电镜结果显示，添加500μM FAC培养后，高表达FTH1的SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞质内可见大量铁颗粒影；而无 FTH1表达的 SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTH1仅在部分细胞质内发现铁颗粒影。正常阴性对照组内无明显铁颗粒影显示。　　3 MRI检测SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞移植物中FTH1的诱导表达　　为了检测 SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞移植物中 FTH1诱导表达的动态变化，我们在裸鼠饮水中加入1 mg/ml Dox和5 mg/ml FAC喂养不同时间后行MR扫描发现：未加入Dox和FAC，即FTH1基因表达沉默“OFF”时，双侧肿瘤组织信号无明显差别；加入Dox和FAC喂养5 d，即开启基因表达5 d“ON”，SK-N-SH/Tet-on/FTH1肿瘤组织信号较对侧明显降低；撤走Dox和FAC，即再次关闭FTH1表达“OFF”，恢复正常饮水7 d后，SK-N-SH/Tet-on/FTH1肿瘤组织信号回到最初基础水平，与对侧比较无明显差别。以上结果证明SK-N-SH/Tet-on/FTH1细胞移植物中FTH1基因的表达具有“开关”功能，利用MRI能够检测到FTH1表达的动态变化，且基因表达与Dox作用时间存在依赖关系。　　为了探究体内FTH1的表达是否与Dox浓度也存在一定依赖关系，我们在荷瘤裸鼠饮水中加入不同浓度Dox和5 mg/ml FAC喂养5 d后发现：Dox浓度为1 mg/ml时，SK-N-SH/Tet-on/FTH1的R2值有一定程度升高；Dox浓度为2 mg/ml时， R2值是明显升高的（P＜0.05）；继续增加Dox浓度，R2值反而降低，至Dox浓度为6 mg/ml时，双侧肿瘤组织的信号无明显差异。　　MR扫描结束后，3组（None、FAC、Dox/FAC）裸鼠肿瘤组织的普鲁士蓝染色结果显示：Dox/FAC组SK-N-SH/Tet-on/FTH1肿瘤组织内可见明显大量的蓝染铁颗粒；而同组对侧SK-N-SH（未表达FTH1）和 FAC组裸鼠双侧肿瘤组织（未表达 FTH1）内仅在少部分细胞质内发现蓝染铁颗粒；正常饮水的裸鼠双侧肿瘤组织内均未见明显蓝染铁颗粒。与此同时，透射电镜结果显示Dox/FAC组SK-N-SH/Tet-on/FTH1肿瘤组织内可见较多的黑色致密铁颗粒影，与普鲁士蓝染色结果一致。　　最后，HE染色显示SK-N-SH/Tet-on/FTH1肿瘤组织在高表达FTH1及聚集FAC后无明显病理改变。　　结论：　　本实验成功构建Tet-on可调控FTH1基因表达的慢病毒载体并感染人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH），证明了FTH1在SK-N-SH/Tet–on/FTH1细胞中的可诱导表达以及MRI体内外检测FTH1可诱导表达的可行性。这为实现移植细胞的活体示踪提供了一种可调控的、安全的MRI报告基因成像方法。