论文部分内容阅读
维生素C又称抗坏血酸（AsA）,是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质（Asada and Takahashi, 1987）,在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用,它可以与单线态氧（O21）、超氧自由基(O-.2)、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（HO-）等活性氧反应,保持维生素E的还原状态（Asada, 1994）,并可做为抗坏血酸过氧化物酶的底物（Conklin et al., 1996, 1997; Noctor and Foyer, 1998; Smirnoff, 2000; Sanmartin et al., 2003）。植物中AsA的重要性不仅在于它在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用,而且近年来的研究发现,AsA对于光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及一些重要次生代谢物和乙烯的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）是植物AsA生物合成途径的第一个关键酶,其催化所得产物GDP-甘露糖也用于细胞壁碳水化合物的合成和蛋白糖基化。GMPase对提高植物体内AsA含量,增强植物的抗胁迫能力具有非常重要的作用。本研究从番茄叶片中克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因,研究了在温度逆境下该基因在番茄各器官中转录水平的表达,然后将构建的该基因正义和反义表达载体用农杆菌介导法导入烟草植株和马铃薯植株中,研究其在烟草和马铃薯体内的功能及表达,并进一步研究了转反义基因烟草抗坏血酸含量和在高温和低温度逆境下抗氧化系统的变化,主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的中间片段,再通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长1402 bp cDNA,ORF为1083 bp,编码361个氨基酸的多肽,分子量约为43 kDa。同源序列比较发现,番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因序列与马铃薯、烟草、紫花苜蓿、拟南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的序列高度同源,因此推断我们获得的全长cDNA编码的产物是GDP-甘露糖焦磷酸化酶,该基因命名为GMPase。聚类分析也表明GMPase与马铃薯、烟草、紫花苜蓿、拟南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的亲缘关系很近。2. Northern杂交结果表明,GMPase基因在番茄不同器官中呈非特异性表达,以叶片中表达水平最高,其次为果实,茎、根中表达量最少。其表达水平在48h内随温度胁迫处理时间的延长而增加,但3h时其表达较低,说明GMPase的表达受温度胁迫诱导。3.将获得的GMPase基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的烟草植株及转正义基因的马铃薯植株。4.在转反义GMPase基因烟草中抑制了GMPase基因的表达,GMPase特异探针标记的Northern杂交结果表明GMPase基因在转反义GMPase基因烟草中在常温和温度胁迫条件下均不表达,而野生烟草中GMPase基因表达水平在48小时内随温度胁迫处理时间的延长而增加,但3h时其表达较低,结果与野生番茄相同。5.构建了原核表达载体pET-GMPase,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,转正义烟草植株中GMPase基因已在蛋白水平过量表达,转反义烟草植株中GMPase基因表达被抑制。6.与野生型烟草相比,转反义烟草叶片抗坏血酸含量降低30%-40%,表现出与野生烟草不同的表型。转反义基因植株在组织培养过程就开始开花,且所有转反义基因植株在7-8片叶时均开始开花,而野生烟草没有出现这种现象,当其生长至25-28叶时才开始开花,转反义GMPase基因烟草开花时间比野生烟草提前近2个月。此外,在7-8叶时,转反义基因烟草的节间显著长于野生烟草且叶片较薄、较小,并出现早衰的现象。7. GMPase基因的抑制表达明显降低了转反义基因烟草的抗氧化能力,具体表现为在低温（4℃）和高温（40℃）胁迫下,转反义GMPase基因烟草叶片的SOD、APX和CAT活性明显低于野生烟草,而其叶片MDA和H2O2含量则正好相反,大大高于野生烟草。8.上述研究结果充分证明了GMPase基因在植物抗坏血酸生物合成中的关键作用。尽管GMPase并非清除活性氧的抗氧化酶,但是GMPase基因的表达却与作物的抗氧化能力密切相关。