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目的1.观察在不同浓度及时间的香烟烟雾作用下,人气道平滑肌细胞增殖和凋亡的变化趋势;2.探讨香烟烟雾促进人气道平滑肌细胞增殖/凋亡失衡是否通过线粒体凋亡途径或死亡受体途径进行,及是否受Bcl-2家族和TNFR超家族的调控;3.探讨在香烟烟雾作用下,人气道平滑肌细胞中ROS的变化是否调控细胞周期调控因子NF-κB的表达,进而影响平滑肌细胞的增殖和凋亡。材料与方法本实验采用组织块贴壁法原代培养人气道平滑肌细胞(HASMCs),用胰蛋白酶消化法传代细胞,并将HASMCs随机分成4个时间干预组:2.5%CSE、5%CSE、10%CSE和20%CSE组,3个时间干预组:24小时、48小时和72小时组及对照组。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学染色法检测不同组细胞的增殖程度和活性情况。AO/EB荧光染色和流式细胞术分别检测细胞凋亡的形态学变化和细胞周期动力学变化。运用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtime- PCR)检测不同浓度和时间CSE作用下Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL和NF-κB在mRNA水平的变化。用免疫细胞化学法检测不同浓度CSE作用后Bcl-2和Bax在蛋白水平的变化。用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验和DCFH-DA荧光染色法检测HASMCs中活性氧(ROS)的表达水平。结果1.除了2.5%CSE 24小时干预组细胞有少许促增殖作用外,CSE对HASMC的增殖主要起着抑制作用,且随着作用时间的延长和CSE浓度的增加,细胞增殖受抑的程度也增加,细胞增殖速度减慢,呈剂量-效应关系和时间-效应关系(n=6,P<0.05)。2.与对照组比较,AO/EB染色结果显示:随着CSE干预浓度的增高,HASMC的凋亡和坏死率均增加,但是凋亡细胞占据死亡细胞的大多数。流式细胞周期分析显示:10%CSE作用于HASMC不同时段以后,随着作用时间的延长,与对照组(1.74±0.21)相比,24小时组(2.36±0.24),48小时组(7.02±0.39)和72小时组( 17.39±0.87)亚G1期的凋亡细胞所占的比例呈增加的趋势(n=6,P<0.01);不同浓度的CSE作用于HASMC 48h以后,可见随着CSE浓度的增加,与对照组(1.74±0.21)比较,2.5%CSE组(2.46±0.11),5%CSE组(3.01±0.15),10%CSE组(7.02±0.39)和20%CSE组(13.48±0.52)处于亚G1期的凋亡细胞所占比例呈增加趋势(n=6,P<0.01)。3.与对照组比较,CSE各干预组中Bcl-2 mRNA水平表达下降,Bax、Fas mRNA水平表达上升,且呈时间和浓度依赖性(n=3,P<0.05);Bad mRNA水平表达在各CSE浓度干预组均呈浓度依赖性升高,但不呈规律的时间依赖性(n=3,P<0.05);FasL mRNA水平表达无明显变化。4.与对照组比较,CSE各干预组中Bcl-2和Bax的蛋白表达水平分别呈浓度和时间依赖性降低和增高(n=3,P<0.05)。5.与对照组比较,各CSE干预组HASMC胞内及总的ROS含量呈时间和浓度依赖性升高(n=6,P<0.05),NF-κB在mRNA水平表达除在2.5%CSE 24小时组表达增高以外,在其余各组的表达呈时间和浓度依赖型降低(n=3,P<0.05),NF-κB的P65亚基和P50亚基的表达一致,均符合上述规律。结论低浓度(﹤2.5%CSE)短时间(24小时内)香烟烟雾作用下可引起人气道平滑肌细胞增殖,超过此浓度和时间范围外,香烟烟雾则抑制气道平滑肌细胞的增殖及促进其凋亡并呈CSE时间和浓度依赖性。细胞凋亡的水平与Bcl-2家族抗凋亡基因(Bcl-2)/促凋亡基因(Bax、Bad)比例失衡,Bcl-2/Bax蛋白表达比例失衡以及TNFR超家族中Fas基因表达增加相关。并且,随着CSE干预浓度和时间的增加,HASMCs内ROS的含量亦随之增加,其在低水平条件下可以促进NF-κB基因表达的增加,在高水平条件下则抑制NF-κB基因的表达,这种变化趋势与细胞的增殖和凋亡趋势相符。这些说明:1.除了在较低浓度条件下以外,CSE对HASMC的主要作用是抑制增殖和促进凋亡引起增殖/凋亡比例失衡,这可能是吸烟COPD患者发病的重要作用机制;2.在HASMCs中,香烟烟雾对其的促凋亡作用可以通过线粒体途径和死亡受体途径进行,但是线粒体途径的作用较死亡受体途径更为明显;3.气道平滑肌细胞中ROS含量是与香烟烟雾的浓度和作用时间成正比增加的,但是ROS对NF-κB呈双向调节作用,低浓度促进其表达,高浓度抑制其表达。而这种与细胞增殖和凋亡相符的变化趋势说明活性氧与NF-κB在CSE致HASMCs增殖和凋亡失衡中可能起着枢纽性调节作用。活性氧可能参与某些信号传导通路,通过调节NF-κB的表达进而影响气道平滑肌细胞的增殖和凋亡。因此,活性氧和NF-κB可能在COPD的发病机制中具有重要的作用并可能是气道平滑肌细胞增殖/凋亡失衡的触发机制。