翡翠贻贝糖胺聚糖抗肿瘤活性及其免疫调节作用的研究

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目的:以翡翠贻贝全脏器为原料,优化翡翠贻贝糖胺聚糖粗品(PVG)的提取工艺条件,经初步纯化后对其抗肿瘤活性进行研究,并探讨其在免疫调节作用方面的抗肿瘤机理。方法:1.采用二次回归正交旋转组合设计研究料液比、加酶量、酶解时间3个因素对糖胺聚糖粗品得率与糖胺聚糖含量乘积的影响,从而确定翡翠贻贝糖胺聚糖粗品(PVG)提取的最佳工艺条件。2.将粗品溶解后,调整溶液pH值,使大部分蛋白沉淀后,冷冻干燥得精制品(PVG-1),DEAE-52-纤维素纯化PVG-1得到翡翠贻贝糖胺聚糖纯化品(PVG-1a)3.采用最大耐受剂量实验对PVG-1的急性毒性进行检验。4.MTT法检测PVG-1和PVG-1a对体外培养的K562慢性髓性白血病细胞、CNE-2Z人鼻咽癌细胞和S180骨肉瘤细胞的抑制作用,并探讨PVG-1和PVG-1a对5-Fu的增敏作用;在体外实验基础上,体内实验验证PVG-1对S180移植瘤的抑制作用。5.采用计算免疫器官指数法检测PVG-1对正常小鼠、免疫抑制小鼠及荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数的影响;检测PVG、PVG-1、PVG-1a体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红及产生一氧化氮(NO)能力的影响;通过脾细胞增殖实验检测PVG、PVG-1、PVG-1a体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;通过脾淋巴细胞与K562肿瘤细胞的共培养,体外检测PVG、PVG-1、PVG-1a对自然杀伤细胞(NK细胞)活性的影响。结果:1.获得了翡翠贻贝糖胺聚糖提取的最佳工艺组合:液料比2.30:1、加酶量0.94%、酶解时间3.46h,模型预测值为25.50(×10-4),重复验证实验结果与预测值的标准误差为1.10%,低于5%。重复验证实验糖胺聚糖粗品平均得率为0.99%,糖胺聚糖平均含量为26.04%。2.经过初步精制和离子交换柱层析纯化,翡翠贻贝糖胺聚糖的含量逐步提高,精制品PVG-1中糖胺聚糖含量为45.6%;经柱层析后的纯化品中糖胺聚糖含量为59.4%。3.最大耐受量实验结果显示,翡翠贻贝糖胺聚糖精制品PVG-1对小鼠的经口急性毒性剂量大于15.0 g·kg-1。4.(1)PVG-1对K562慢性髓性白血病细胞、CNE-2Z人鼻咽癌细胞的生长有抑制作用;PVG-1和PVG-1a对体外培养的S180骨肉瘤细胞的生长有显著抑制作用;PVG-1、PVG-1a与5-Fu合用可以增敏5-Fu的抗肿瘤药效。(2)PVG-1对小鼠体内S180移植瘤的生长具有显著抑制作用,200 mg·kg-1的PVG-1的抑制率达到60.6%;CTX与PVG-1合用组的抑制率达到78.8%,显著提高了CTX的抑瘤效果。5.(1)PVG-1能够提高正常小鼠脾指数和胸腺指数,200mg/kg剂量PVG-1对正常小鼠脾指数的提高最明显,100mg/kg剂量PVG-1对对正常小鼠胸腺指数的提高最明显; PVG-1能够修复由CTX引起的小鼠免疫低下状况。(2)PVG-1各剂量组都能够提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数,在所选实验剂量范围内表现出良好的剂量效应关系;PVG-1中剂量(100 mg/kg)能修复由于CTX治疗肿瘤的同时导致的荷瘤小鼠免疫低下。(3)PVG、PVG-1和PVG-1a能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和产生NO的能力; PVG、PVG-1和PVG-1a各剂量组均能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,样品相同剂量条件下,PVG-1a的刺激指数高于PVG-1,PVG-1高于PVG;200μg/ml的PVG-1a与ConA协同刺激脾淋巴细胞增殖的效果最好,刺激指数达到1.63。(4)PVG、PVG-1和PVG-1a的四个剂量作用的NK细胞能够增强NK细胞的杀伤活性;PVG-1a组作用的NK细胞在总体上杀伤活性好于PVG、PVG-1。结论:通过响应面分析得到翡翠贻贝糖胺聚糖提取的最佳工艺条件;翡翠贻贝糖胺聚糖对K562、CNE-2Z和S180肿瘤细胞有抑制作用,能增敏5-Fu和CTX的抗肿瘤药效;翡翠贻贝糖胺聚糖具有调节免疫功能,其体内抗肿瘤作用机理之一可能是调节机体免疫力。
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