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成体干细胞存在于成体的各种组织器官中,是维持组织稳态和组织器官再生的重要因素。组织器官衰老、个体衰老及糖尿病、阿尔茨海默病等老龄化疾病的发生均可归因于成体干细胞衰老。因此,如何激活衰老的成体干细胞使其“返老还童”,是我们急需解决的关键问题。成体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是组织工程学和再生医学理想的种子细胞。然而,无论供体年龄大小,体外培养的MSCs都将随着传代次数的增加出现复制性衰老。这将造成组织工程研究中种子细胞的缺乏,严重限制其在组织器官修复、自体移植及临床疾病治疗中的应用。2009年“NAD World”衰老理论提出:烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是NAD合成的限速酶,能够决定代谢中NAD水平和Sirt1活性,我们称之为Nampt/NAD/Sirt1轴,对细胞代谢、细胞衰老、细胞周期的维持及个体衰老起重要作用。我们在前期工作中发现,体外连续传代培养使大鼠MSCs(rMSCs)出现衰老,随着传代次数的增加,Nampt表达逐渐降低;来源于老龄大鼠的rMSCs发生衰老,Nampt表达水平明显低于年轻大鼠。提示Nampt可能参与调控rMSCs衰老。由此,我们进一步推测:Nampt可能通过Nampt/NAD/Sirt1轴来调控rMSCs衰老。本研究以1-2月龄大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)为研究对象,利用基因过表达技术、RNA干扰技术(基因沉默)或抑制剂,探讨Nampt对rMSCs衰老的调控作用。通过观察细胞形态学变化,分析细胞增殖能力及细胞周期,检测细胞成骨、成脂分化能力、衰老相关b-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性以及衰老相关因子p16INK4a表达,明确rMSCs衰老的发生。应用RT-q PCR及Western blot检测rMSCs中Nampt表达,并通过检测细胞内Sirt1活性及NAD含量,阐明Nampt调控rMSCs衰老的可能机制。所得结果如下:1、通过体外连续传代培养获取P3、P10代rMSCs,与P3 rMSCs(年轻细胞)相比,P10 rMSCs(衰老细胞)呈“衰老样变”,细胞长宽比降低,表面积增加,细胞SA-β-gal活性明显增强。2、Nampt抑制剂-FK866或慢病毒介导的Nampt基因沉默使年轻细胞P3rMSCs出现“衰老样变”,细胞长宽比降低,表面积增加;细胞生长速度减慢,增殖能力降低,群体倍增时间显著延长;大多数细胞阻滞于G1期;细胞成骨、成脂分化能力降低;细胞SA-β-gal活性增强以及衰老相关因子p16INK4a表达上调。3、慢病毒介导的Nampt过表达使衰老细胞P10 rMSCs形态由衰老样变细、变小,细胞长宽比增加,表面积减少;细胞生长速度加快,增殖能力增强,群体倍增时间明显缩短;阻滞于G1期的细胞减少;细胞成骨、成脂分化能力提高;细胞SA-β-gal活性降低以及衰老相关因子p16INK4a表达下调。4、P3代rMSCs的Nampt表达及NAD含量和Sirt1活性均明显高于P10代rMSCs。Nampt抑制(药物抑制或基因沉默)使rMSCs内NAD含量下降,进而使Sirt1活性降低;Nampt过表达使rMSCs内NAD含量增加,进而上调Sirt1活性;参与NAD合成的外源性小分子物质NAM或NMN均能抑制或减缓FK866诱导的rMSCs衰老。综上所述,Nampt对rMSCs衰老具有调控作用,Nampt抑制能诱导或加速rMSCs衰老,而Nampt过表达则能抑制或延缓rMSCs衰老;该作用可能是通过Nampt介导的NAD合成及Sirt1活性来实现的。本研究既为探索干细胞衰老的机制奠定了基础,也为解决干细胞衰老所致的种子细胞不足问题,延缓干细胞衰老及防治老龄化疾病提供了新策略。