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我们报道了一个病例,根据流式细胞仪及免疫荧光杂交技术检测该病例淋巴结,发现其含有50.26%恶性淋巴细胞和50%IGH/BCL-2阳性肿瘤细胞。为了确定肿瘤内皮细胞是否具有肿瘤的恶性特征,我们利用免疫磁珠法和CD31单克隆抗体从肿瘤组织中分离内皮细胞,其形态学上呈扁长型的细胞形态,胞浆中具有Weibel-Palade小体;流式细胞术的结果显示,分离的内皮细胞高表达vWF和CD34,其纯度超过90%。随后,我们利用荧光原位杂交技术检测纯化的内皮细胞染色体状况,结果发现绿色IGH探针和红色BCL-2探针的单融合信号,与标准的滤泡型淋巴瘤14、18号染色体双融合信号不同。这一独特现象也在淋巴瘤细胞中观察到。这可能因为IGH位于的14号染色体断裂点不同导致失去一个绿色融合信号。从肿瘤中分离的内皮细胞,其染色体异常的比例达到18%,提示滤泡型淋巴瘤的一部分内皮细胞具有与肿瘤细胞相同的染色体异常等恶性特征。TNF-α对肿瘤有双刃剑的作用:一方面TNF-α能杀伤肿瘤细胞而无碍于正常细胞,另一方面TNF-α也利于肿瘤生长,因为TNFR基因敲除小鼠的肿瘤生长较野生型小鼠缓慢,肿瘤自身表达TNF-α,可以促进肿瘤细胞存活,抵抗凋亡。本研究检测跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)在白血病中的表达,并初步探讨TM-TNF-α在白血病中的作用,观察TM-TNF-α抗体体内外对白血病细胞的杀伤效应。其主要结果如下:1.TM-TNF-α在急性白血病中广泛表达:我们采用流式细胞术对10例健康供者、33例AML及22例ALL病人的骨髓单个核细胞进行TM-TNF-α表达的检测,其中ALL患者TM-TNF-α强阳性者约占86.36%,AML强阳性患者约占72%,其中15例M5强阳性者占86.67%。提示部分白血病患者(约2/3)的白血病细胞高表达TM-TNF-α。2.比较正常干细胞和白血病干细胞对TM-TNF-α的表达:AML的CD34+CD38-干细胞TM-TNF-α强阳性者占88.89%,而ALL的CD34+CD7-(CD19-)干细胞强阳性者占85.71%,但正常人CD34+CD38-干细胞则几乎不表达TM-TNF-α。白血病干细胞和白血病细胞表达TM-TNF-α呈正相关。3.ALL表达TM-TNF-α与髓外浸润相关:有髓外浸润的ALL细胞TM-TNF-α表达率较无髓外浸润者高(p<0.05),提示TM-TNF-α表达越高,越易出现白血病细胞的髓外浸润。4.干扰白血病细胞表达TNF-α,可抑制其增殖,促进其凋亡:沉默TNF-α表达后THP-1增殖减缓,并且凋亡稍有增高。5.TM-TNF单抗诱导CDC和ADCC效应:与阴性对照美罗华相比,抗TM-TNF-α抗体有一定CDC(30%-35%)和ADCC效应(40%-45%),与上市抗S-TNF单抗类克的效应之间无明显差异。6.抗TM-TNF-α抗体体内杀伤效应:TM-TNF-α抗体治疗组较美罗华对照组小鼠肿瘤发病率低,且成瘤体积减小,与类克治疗组无明显差异。结论:TM-TNF-α在部分白血病中高表达,且与白血病细胞增殖、浸润密切相关。单独使用TM-TNF-α抗体减少肿瘤发病率,并抑制肿瘤生长。本研究结果为以TNF-α为靶点靶向治疗白血病提供了实验依据和新线索。迄今为止,Tim-3分子发现的唯一配体是galectin-9,本实验室前期工作证实淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3可抑制T细胞活化和增殖,从而导致肿瘤免疫逃逸。为全面了解Tim-3的信号途径,本研究成功构建表达sTim-3的原核和真核蛋白,并发现THP-1单核肿瘤细胞株表达galectin-9以外的配体。通过免疫共沉淀的方法和液相质谱钓取与sTim3共沉淀的膜受体,并初步探讨Tim3对其功能的影响。其主要结果如下:1.人sTim3原核表达及检测:我们采用分子克隆技术,将人Tim3胞外段基因序列按照细菌嗜好密码修改,插入原核表达载体pet28a+中,成功进行原核表达。其表达sTim3可与两种淋巴瘤细胞系Su及Hut78表面结合。2.人sTim3-IgG1CH融合蛋白真核表达载体构建与表达:利用重叠PCR技术将Tim3的信号肽和胞外段基因序列连接(sTim3),又将sTim3与IgG1重链恒定区基因序列连接(sTim3-IgG1CH),并插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将该质粒稳转CHO细胞,经流式和免疫印迹证实CHO细胞表达并分泌sTim3-IgG1CH融合蛋白。3.用sTim3-IgG1CH融合蛋白筛选表达Tim3未知配体的细胞株:用流式分别检测八种白血病细胞系,其中HL-60、Kassumi、RS4-11、Raji、Su的galectin9的表达率与sTim-3-IgG1CH同细胞的结合率基本一致;而THP-1表达galectin-9仅55%,但sTim3-IgG1CH与细胞的结合率则达到99%,提示THP-1可能表达Tim3未知配体。4.免疫共沉淀钓取Tim3未知配体:用免疫共沉淀和和液相质谱钓取与sTim3-IgG1CH共沉淀的膜受体,证实除了galectin-9外,还有galectin-1及galectin-8,同时还获得Tim3信号途径中T细胞活化抑制分子1。5.sTim3-IgG1CH融合蛋白对THP-1细胞的作用:利用CBA试剂盒观察sTim3-IgG1CH对THP-1分泌细胞因子的影响,证实sTim3可明显抑制THP-1细胞分泌TNF-α,对IL-10分泌有轻度促进作用。结论:本研究初步证实Tim3结合的未知受体可能是galectin家族成员;sTim3明显抑制单核细胞分泌TNF-α,提示Tim3有可能促进巨噬细胞向M2型转化。但是,这些结论还需用大量实验进一步证实。本研究结果为Tim3抑制免疫机制提供了新线索。