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家蚕作为一种良好的鳞翅目模式生物,在其变态发育中发生着大量的细胞凋亡过程,是作为细胞凋亡研究的一个理想材料。此外在哺乳动物的研究中发现,GATA6上调会促进Bax蛋白的表达,引起细胞凋亡。而在斑马鱼中的研究发现,GATA6基因的表达水平下调会引起肠道平滑肌的功能缺陷,还会引起肠道的异常发育。家蚕是完全变态昆虫,一生要经历多次蜕皮期,每次蜕皮过程中中肠组织都要经历一次重塑,即伴随着大量旧细胞的自噬和凋亡,新细胞也在不断产生,此过程中,需要各分子网络的精确调控。GATA是基因启动子中的一段保守核酸序列,目前发现了许多可识别GATA序列的转录调节蛋白,都具有调节转录活性的功能,因此这些蛋白统称为GATA转录因子。家蚕中已报道的GATA转录因子有Bm GATAα、Bm GATAβ与BmGATA6。关于Bm GATAα的功能暂无报道。Drevet等报道了Bm GATAβ,通过选择性剪切,形成3种剪切体:Bm GATAβ1特异地在家蚕性腺中表达;Bm GATAβ2在幼虫与蛹的多种组织中表达;而Bm GATAβ3只在蛹期卵泡中表达。且Bm GATAβ1与卵泡细胞的形成和绒毛膜基因的表达有关,而有关另外2种剪切形式的功能尚未见报道。关于BmGATA6,只在NCBI中收录了序列信息,因此我们对BmGATA6的功能进行了初步的研究。本研究的主要结果如下:1.BmGATA6全长克隆及分析家蚕GATA转录因子BmGATA6的c DNA全长4 011 bp,ORF长为1 974 bp,编码657个氨基酸,包括205 bp的5′非翻译区序列(5′UTR)和1 832 bp的3′非翻译区序列(3′UTR)。该基因位于15号染色体上,基因全长12 326 bp,为多外显子基因,共含有8个外显子和7个内含子,具有2个典型的GATA锌指结构域,分别位于第470—521和531—582氨基酸区域。与其它物种中的BmGATA6同源序列进行比对,构建系统进化树,结果显示BmGATA6较为保守,且与帝王斑蝶的GATAc聚为一类,与其为同源蛋白。2.BmGATA6表达分析RT-PCR结果显示BmGATA6在5龄第3天家蚕中肠中显著高量表达,其次在马氏管中有少量表达,而在其他组织中没有检测到BmGATA6的表达。同时RT-PCR结果显示BmGATA6在4龄眠期到熟蚕期的中肠组织中持续高表达。3.BmGATA6多克隆抗体的制备选取BmGATA6编码框中N端944bp的特异片段,构建BmGATA6原核表达载体,通过不同温度与IPTG浓度诱导发现,BmGATA6重组蛋白在16℃诱导主要存在于上清中,在37℃诱导主要存在于包涵体中。在0.6 mmol?L-1的IPTG、16℃下诱导20 h为最佳条件,利用镍柱亲和层析法获得较纯的BmGATA6重组蛋白,并利用纯蛋白多次免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用ELISA法对抗体效价进行了检测,显示BmGATA6抗体效价均高达1﹕128 000。Western blot结果显示BmGATA6抗体能特异的识别家蚕BmGATA6蛋白,其大小约为75 k D,与预测大小相符。免疫荧光结果显示BmGATA6蛋白在家蚕中肠的各类细胞中均有较高表达,且定位于中肠细胞的细胞核中。4.BmGATA6在中肠中的功能研究BmGATA6蛋白的表达分析发现,BmGATA6在中肠中高表达,其它组织表达较低,而在中肠的发育各时期中预蛹期时的表达量最高。我们利用ds RNA干涉家蚕熟蚕期的BmGATA6基因。实验结果发现,干涉24h后,中肠BmGATA6的表出现了明显的下调,且BmGATA6的中肠免疫荧光发现,中肠肠壁表达的BmGATA6被明显的下调表达。我们进一步利用TUNEL对24h干涉后的中肠进行检测,发现BmGATA6下调表达的肠壁细胞上未检测到TUNEL信号,而肠壁内部由脱落细胞形成的无定形团块内有大量BmGATA6的表达。而干涉BmGATA6 2天后发现,对照组的幼虫正常发育,而实验组的幼虫出现致死现象,最后实验组的幼虫全部死亡。