论文部分内容阅读
类风湿关节炎（RA）是一种系统性自身免疫性疾病,其特征是关节滑膜组织发生炎症性改变,滑膜组织增生,血管翳形成,关节软骨损伤和骨质破坏,最终导致关节畸形及功能丧失。RA的病因尚未完全阐明。既往研究表明,遗传和表观遗传因素均能影响RA的发生。作为最丰富的RNA修饰之一,N6-甲基腺苷（m6A）修饰对RNA的生物发生和功能是必需的,并且其修饰异常与各种疾病有关。然而,m6A甲基化修饰在RA的作用尚不清楚。大量研究表明已m6A甲基化修饰参与调控多种免疫细胞,如外周血单核细胞（PBMC）、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等的生物学功能。鉴于这些免疫细胞及成纤维样滑膜细胞（FLS）在RA病理进程中具有关键作用,我们推测m6A甲基化修饰在RA中的潜在作用可能是通过调节不同免疫细胞及FLS的生物学功能来实现的,但其具体的作用及机制尚不清楚。此外,基于m6A甲基化修饰而开发的药物十分稀少,虽然目前m6A修饰去甲基化酶脂肪和肥胖相关蛋白的抑制剂已被开发,但其效果仅经过体内外实验验证,其有效性和安全性仍有待评估。更重要的是,目前还没有开发基于m6A甲基化修饰治疗RA的药物。基于以上问题,本论文主要包括以下三部分内容:第一部分:缺氧条件下RNA m6A修饰去甲基化酶ALKBH5在FLSs中的作用及机制研究研究方法:（1）收集RA患者及骨关节炎（OA）患者的膝关节滑膜组织,利用免疫组织化学（IHC）、RT-PCR及Western blot方法检测组织中缺氧诱导因子（HIF）-1α,HIF-2α及ALKB同系物5（ALKBH5）的基因和蛋白表达水平,初步探索HIF-1α、HIF-2α及ALKBH5在RA病理过程中的作用;（2）构建胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型,采用关节炎评分（AI）方法对大鼠的发病情况进行评估,利用苏木素-伊红（HE）染色、番红O-固绿染色及Micro-CT方法对CIA大鼠模型的关节病理及骨破坏情况进行评估,利用IHC、RT-PCR及Western blot方法检测不同组织中HIF-1α,HIF-2α及ALKBH5的基因和蛋白表达水平,明确其在CIA动物模型中的作用;（3）①将FLS分别置于常氧和缺氧环境中进行培养,用CCK-8方法检测缺氧环境对FLS增殖的影响,利用细胞划痕实验、Transwell实验及罗丹明标记鬼笔环肽染色检测缺氧环境对FLS迁移和侵袭的影响,利用RT-PCR和Western blot方法检测缺氧环境对FLS中HIF-1α、HIF-2α和ALKBH5基因及蛋白表达水平的影响,利用RT-PCR方法检测缺氧环境对FLS中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的影响;②在缺氧和常氧环境中,过表达/敲低ALKBH5,利用细胞划痕实验、Transwell实验及罗丹明标记鬼笔环肽染色检测过表达/敲低ALKBH5对细胞迁移、侵袭的影响,利用RT-PCR方法检测过表达/敲低ALKBH5对FLS中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的影响;③在缺氧环境中敲低FLS中的ALKBH5,收集细胞进行MeRIP-seq检测和分析,利用MeRIP-qPCR、RT-PCR及Western blot方法筛选出ALKBH5下游潜在的靶基因;④利用RT-PCR、Western blot、RNA稳定性实验、Transwell实验、罗丹明标记鬼笔环肽染色、基因过表达、基因敲降等方法,对缺氧环境中ALKBH5与潜在靶基因CH25H的作用关系进行验证;⑤对GEO公共数据库数据进行分析,并利用RT-PCR、IHC、免疫荧光及相关性分析等方法,对RA滑膜组织中CH25H的表达进行分析和检测,明确CH25H在RA病理进程中作用。研究结果:（1）与OA患者组织相比,RA患者滑膜组织中HIF-1α、HIF-2α及ALKBH5的基因与蛋白水平显著上调;（2）大鼠在第二次免疫后第3～4天开始发病,在第二次免疫后第6～8天进入发病高峰;大鼠后爪外观典型照片显示,CIA模型制备成功的大鼠后爪出现严重的肿胀现象;与正常组相比,CIA动物模型踝关节出现严重的病理损伤及骨破坏;与正常组相比,CIA动物模型踝关节及膝关节滑膜组织中HIF-1α、HIF-2α及ALKBH5的的基因及蛋白表达上调;（3）①与常氧环境相比,缺氧环境可促进FLS的增殖、迁移、侵袭,促进FLS 中 HIF-1α、HIF-2α、ALKBH5 的基因和蛋白表达,促进 FLS 中 TNF-α、IL-1β3和IL-6 mRNA表达;②缺氧环境中,过表达ALKBH5可促进FLS的迁移、侵袭及TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达,敲低ALKBH5则可抑制FLS的迁移、侵袭及TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达;③从MeRIP-seq结果中分析得到的49个m6A甲基化修饰及转录水平均有显著变化的基因,筛选出转录组表达量相对较高,且变化差异倍数更高的G蛋白偶联受体结合蛋白α14（GNA14）、胆固醇25羟化酶（CH25H）和B淋巴细胞瘤2（BCL2）进行验证。结果发现,敲低ALKBH5后,GNA14、CH25H和BCL2的m6A修饰水平增加。RT-PCR和Western blot结果显示,敲低ALKBH5后,BCL mRNA和蛋白表达水平变化不明显,GNA14和CH25H mRNA和蛋白表达均显著下调,CH25H下调更为明显,因此确定CH25H为ALKBH5下游的潜在靶基因;④缺氧环境中,ALKBH5表达可影响CH25H mRNA的稳定性,敲低CH25H可抑制FLS迁移、侵袭,下调FLS中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达,过表达CH25H则可以促进FLS迁移、侵袭,上调FLS中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达,且过表达CH25H可逆转ALKBH5低表达所致的FLS迁移侵袭能力减弱及炎症因子表达降低。⑤GEO数据库GSE55457,GSE55235数据集中,与OA患者相比,RA患者滑膜组织中CH25H表达水平显著升高;在GSE36700数据集中,RA患者滑膜组织中CH25H表达水平也高于OA患者,但无显著差异;RT-PCR结果显示,与OA组患者相比,RA患者滑膜组织中CH25H的mRNA表达水平显著升高;IHC结果显示,CH25H在RA患者滑膜组织中表达上调;免疫荧光共染色结果显示,与OA组相比,RA患者滑膜组织中CH25H和ALKBH5均表达上调;相关性分析结果显示,CH25H的mRNA水平与m6A水平呈负相关,与ALKBH5 mRNA水平呈正相关。这说明滑膜组织中ALKBH5和CH25H的表达上调与RA病理进程直接相关。第二部分:RNAm6A甲基化修饰在RAPBMC中的作用研究研究方法:（1）收集RA患者PBMC,进行MeRIP-seq及RNA-seq高通量测序分析,绘制RAPBMC的m6A甲基化修饰图谱;（2）根据MeRIP-seq结果分析差异甲基化修饰基因,并对差异甲基化修饰基因参与的生物学功能及信号通路进行分析;（3）根据RNA-seq结果分析差异基因,并对差异基因参与的生物学功能及信号通路进行分析;（4）进行MeRIP-seq和RNA-seq联合分析,分析甲基化修饰及转录水平均有差异的基因,并对这些差异基因参与的生物学功能和通路进行分析,明确m6A甲基化修饰在RAPBMC中的关键作用。研究结果:（1）绘制了 RA PBMC的m6A甲基化修饰图谱;（2）筛选出35个m6A甲基化修饰水平和mRNA水平均有显著差异的基因;（3）这些甲基化修饰水平和mRNA水平均有显著差异的基因参与多个生物学功能及信号通路,在RA中具有重要作用。第三部分:结合第二部分研究内容,挖掘雷公藤甲素（Triptolide,TP）治疗RA的新靶点研究方法:（1）基于RA PBMC的MeRIP-seq及RNA-seq结果,结合生物信息学分析,挖掘TP治疗RA的新靶点;（2）对GEO数据库不同数据集中滑膜组织的数据进行检索,分析目标基因在滑膜组织中的表达情况;（3）利用分子对接及RT-PCR方法,对TP治疗RA新靶点进行初步验证。研究结果:（1）TP的靶蛋白与第二部分分析得到的RA差异基因之间存在密切的网络联接,特别是胰岛素样生长因子2结合蛋白3（IGF2BP3）,TUBB2A,DYNC1I1,FOSL1等基因与TP的靶蛋白之间存在较多网络联接;（2）在GEO数据库4个数据集中,与正常滑膜组织和OA滑膜组织相比,IGF2BP3在滑膜组织中的表达显著上调,并且其表达趋势与PBMC中一致,这提示我们IGF2BP3在组织和细胞中表达较为稳定;（3）分子对接结果显示TP与IGF2BP3的亲和力分数为-8.6 kcal/mol,说明TP与IGF2BP3具有较强的结合活性。RT-PCR结果显示,TP可降低PBMC和滑膜成纤维细胞系MH7A中IGF2BP3的表达,提示IGF2BP3是TP治疗RA的潜在新靶点,但其深入的作用机制将在后续研究中继续探索。研究结论:（1）HIF1α/2α-ALKBH5-CH25H通路在RA病理进程中发挥关键作用,其可能是RAFLS迁移、侵袭及炎症发生的关键通路之一;（2）RA PBMC中m6A甲基化修饰基因与疾病密切关联,m6A甲基化修饰在RA PBMC发挥重要作用;（3）TP可能通过靶向m6A甲基化修饰结合蛋白IGF2BP3从而发挥治疗RA的作用。