研究背景当今痴呆的发病率逐年上升,在65岁以上的个体中痴呆患病率可达5%一20%,痴呆的高发病率和高致残率给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担,这已使其成为了21世纪最严重的社会问题之一。但无论是阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)还是血管性痴呆(vascular dementia, VD),发病机制目前均不明确,故缺乏有效的预防和治疗手段。因此,积极地探索和研究痴呆的病因和发病机制已成为防治痴呆的当务之急。近年的临床观察发现血管性痴呆患者存在血清甲状腺激素(Thyroid hormones, THs)水平异常,而促甲状腺激素可维持在正常水平,这种激素水平的变化符合正常甲状腺功能病态综合征(Euthyroid sick syndrome, ESS)的改变。正常甲状腺功能病态综合征是指由严重的甲状腺外的全身性疾病、手术和禁食等原因导致的甲状腺功能检测异常,而甲状腺本身并无病变的一组临床综合征。曾经的观点认为这是机体的一种适应性保护反应,可减轻损伤后的应激反应程度,但现在越来越多的人倾向认为这是疾病预后不佳的一种表现。有人提出,正常甲状腺功能病态综合征的发生可能和下丘脑一垂体一甲状腺(Hypothalamus-pituitary-thyroid axis, HPT)轴的功能紊乱有关,各种损伤因素作用于下丘脑,使之发生功能性或结构性病变,甲状腺激素的合成及代谢过程随即受到影响,而减少的甲状腺激素无法负反馈上调HPT轴的上游激素,因此产生一系列激素水平的异常及代谢障碍。在一项对83例70岁以上受试者进行的临床研究中,Ichibangase等人发现在含痴呆及未痴呆的所有受试者中,年龄与血清游离三碘甲腺原氨酸(3,5,3’—triiodothyronine, T3)浓度均呈负相关；血管性痴呆患者的血清游离T3水平显著低于未痴呆者。这些观察提示,认知功能与血清游离T3水平密切相关；在血管性痴呆的患者中,血清游离T3水平可以反映患者的健康及认知状态。本课题组在前期研究中,应用2V0方法制备慢性脑缺血致血管性认知功能障碍(Vascular cognitive impairment, VCI)的动物模型,通过测定慢性脑缺血后脑组织甲状腺激素的水平,发现在大鼠学习记忆能力下降的同时,其脑组织甲状腺素(thyroxine, T4)及三碘甲腺原氨酸的浓度均有所下降,而补充外源性甲状腺激素的慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力明显改善,提示血管性认知功能障碍可能与中枢甲状腺激素代谢异常有关。但甲状腺激素通过何种机制影响大鼠脑缺血后的认知功能尚未见文献报道。因此,有必要进一步明确甲状腺激素在改善血管性认知功能障碍中的作用及机制,为血管性认知功能障碍的防治工作提供必要的理论支持,也为促进患者认知功能的恢复创造一种新的可能。近年来,人们对于血管性认知功能障碍的发病机制进行了比较深入的研究。De Jong等人发现即使在脑血流的恢复期(双侧颈总动脉结扎后6个月至1年内的任何时间点),大鼠仍存在空间学习记忆能力的损害,提示双侧颈总动脉结扎后的记忆障碍不仅仅由脑低灌注本身所引起,也与缺血诱发的永久性损害有关。Imai等人发现,在结扎双侧颈总动脉后第3-7天即可观察到大鼠海马CA1区部分神经元的死亡,术后第二周,出现海马CA1区神经元受损的大鼠为6%-29%,而在术后第四周,该比例增加到55%,这证实了双侧颈总动脉永久性结扎后的慢性脑缺血会造成海马区的神经元损伤。众多研究表明,慢性脑缺血可通过炎性反应及氧化应激引发海马区神经元的去极化、胞内外离子失衡、细胞骨架及膜结构改变、线粒体功能障碍及兴奋性氨基酸毒性等代谢功能异常,从而造成神经细胞的凋亡,而缺血后的海马细胞凋亡则是血管性认知功能障碍的重要致病环节。用神经保护剂对抗缺血脑组织的氧化应激或减轻胞内钙超载,可同时表现出海马区神经元凋亡的减少及空间学习记忆功能的改善,这进一步证明了慢性脑缺血会造成海马区的细胞凋亡,而正是这种细胞凋亡导致了大鼠认知功能的下降。众所周知,甲状腺激素可以影响胚胎脑组织的细胞增殖、分化过程,树突和轴突生长,神经元迁移,髓鞘形成等,对哺乳动物中枢神经系统的发育成熟至关重要。然而,甲状腺激素在中枢神经系统中的作用不仅局限于胚胎与年幼个体,在成年期甚至老年期同样起着至关重要的作用,可以说,甲状腺激素对于个体的影响是终生性的。它可以调控乙酰胆碱、多巴胺等多种神经递质的作用,可以调控细胞因子的表达和酶蛋白的活性,可以通过调控线粒体的功能影响脑组织的能量代谢,也可以通过调节蛋白激酶等信号转导系统调节颅内血管的舒张。成年的甲状腺功能减退症可能造成患者精神行为等方面的异常,在老年患者则更可能造成皮层萎缩导致痴呆,这些都强调了甲状腺激素对于正常脑功能维持的重要作用。研究发现,T3可减少缺血再灌注的心肌组织释放乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)及表达caspase-3,提示其可减少缺血再灌注组织的损伤及细胞凋亡。分别于大脑中动脉阻断1小时及再灌注6小时时予大鼠T4腹腔注射,可抑制缺血脑组织星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,增加脑源性神经生长因子及胶质细胞源性神经营养因子的表达,降低环氧合酶-2(COX-2)及诱导型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase, iNOS)等炎症相关氧化酶的活性,从而减少急性缺血再灌注后脑梗死灶的面积。在星形胶质细胞的培养基中加入T3,可使胶质细胞本身免受高浓度谷氨酸的毒性反应,同时也可增加与胶质细胞共培养的神经元的存活率,提示其对培养的神经元同样具有保护作用。但甲状腺激素对慢性脑缺血海马的细胞是否具有保护作用尚无有力的文献支持。若能设计实验证明其可减少慢性脑缺血大鼠的海马细胞凋亡,将使我们对甲状腺激素改善2V0大鼠认知功能的机制有所了解,并更进一步确证海马细胞凋亡在血管性痴呆发病机制中的重要意义。有研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2是中枢神经系统内程序性细胞死亡的关键调节因素。有研究发现用丙基硫氧嘧啶(PTU)处理造成的大鼠甲状腺激素减退症(甲减)模型存在脑内抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和促凋亡蛋白Bax的上调,同时脑组织内细胞凋亡增多。甲状腺激素干预可增加外伤脑组织的Bcl-2表达从而减少外伤后的神经元凋亡。这些都提示我们甲状腺激素对缺血海马细胞凋亡的调控可能通过对Bcl-2表达的调控实现。但甲状腺激素对Bcl-2的表达及缺血海马细胞凋亡的具体调控时间和方式尚无文献报道。综上所述,课题组前期研究证明：大鼠慢性脑缺血时脑组织T3及T4水平明显低下,并且伴认知功能损害,而补充外源性甲状腺激素可改善缺血损伤的认知功能。为了进一步阐明甲状腺激素修复血管性认知功能障碍的作用及其机制,我们提出假说：甲状腺激素通过减少缺血海马的细胞凋亡改善慢性脑缺血后受损的认知功能；甲状腺激素的这种细胞保护作用是通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达实现的。为证实该假说,本课题拟采用成年大鼠双侧颈总动脉永久性结扎术制备慢性脑缺血致血管性认知障碍的动物模型,并且设置缺血后THs干预处理组,通过尼氏染色、免疫荧光标记及免疫印记检测(Western blotting, WB)等方法,观察不同组大鼠海马的细胞凋亡以及甲状腺激素是否通过调节Bcl-2的表达影响细胞凋亡,以期从细胞保护角度阐明甲状腺激素改善慢性脑缺血后受损认知功能的分子生物学机制,为促进血管性痴呆患者认知功能的恢复提供新的理论依据及治疗靶点。研究方法一.实验分组：将50只成年SPF级雄性大鼠随机分为慢性脑缺血组(n=16),缺血后T3干预组(n=18)和假手术组(n=16)。慢性脑缺血组再随机分为2V07天组(n=8)和2V014天组(n=8)；同样,缺血后T3干预组随机分为T37天组(n=10)和T314天组(n=8)；假手术组随机分为假手术7天组(n=8)和假手术14天组(n=8)。每亚组中各取5只大鼠用作切片染色,其余的用作免疫印记(Western Blotting, WB)检测。二.尼氏染色：通过尼氏染色标记神经元,观察术后14天海马CA1区的组织结构及细胞凋亡情况。三.免疫荧光染色：TUNEL染色分别标记术后7天和14天海马齿状回的凋亡细胞,计算各时间点各组海马齿状回的细胞凋亡指数。四.免疫印迹检测：分别观察术后7天和14天三组大鼠海马区Bcl-2蛋白的表达情况。五.统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计学处理。计量资料用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法,P<0.05定义为有统计学意义。研究结果一、术后14天,假手术组大鼠海马CA1区结构整齐,锥体细胞排列致密,数量较多。与假手术组相比,缺血后的CA1区结构明显松散杂乱,细胞层崩解,神经元排列稀松且数量减少。T3组的海马结构虽与假手术组相比稍显紊乱,但较2V0组的结构完整性强,细胞数目则与假手术组基本一致。二、术后7天,三组齿状回颗粒细胞的凋亡指数从高到低依次为2V0组、T3组及假手术组,但差异无统计学意义(P=0.060)。假手术组术后14天的海马齿状回内可见少量呈紫色的凋亡细胞；2V0组术后14天的海马齿状回内可见大部分细胞发生凋亡；缺血后T3处理组术后14天的海马齿状回约一半的细胞发生凋亡。通过细胞计数及计算可知,三组间的齿状回细胞凋亡指数存在显著性差异(P<0.001),其中2V0组大鼠海马齿状回细胞凋亡指数显著高于假手术组(P<0.001),缺血后T3干预组的海马齿状回细胞凋亡指数明显低于2V0组(P=0.001)。三、各组上样蛋白中GAPDH表达量基本一致。术后7天时三组Bcl-2蛋白的表达量从高到低依次为T3组、2V0组及假手术组;术后14天,2V0组BcL-2蛋白的表达少于假手术组,T3组则多于假手术组和2V0组。研究结论甲状腺激素通过减少缺血海马齿状回及CA1区的细胞凋亡改善慢性脑缺血后受损的认知功能,这一过程是通过调节海马Bcl-2表达实现的。