肝癌在恶性肿瘤中占六分之一,且因极差的预后成为世界上第三大死亡原因。而目前化学治疗的结果不能令人满意,从具有抗癌活性的中(植物)药中提取、纯化有效的抗肿瘤成分,成为世界医学研究的热点。黄连素是一种异喹啉类的生物碱,它在众多药用植物种属中占有很重要的地位。近来人们研究发现黄连素有抗肿瘤的作用,并通过不同机制在体内和体外发挥其抗癌性。大量的实验证实黄连素有抗肿瘤的作用是在对很多肿瘤细胞本身的影响上,主要是通过抑制细胞的增殖、诱导细胞凋亡以及阻止细胞周期的方式。还有研究报道黄连素在体内可以辅助化疗药物降低副作用以抗肿瘤。由于黄连素取自黄连的干燥根茎,且在中医看来黄连归肝、胃、小肠经,泻火解毒作用极强,与其他同类药用植物比偏于治疗中焦,而肝脏则位于中焦,肝癌为“肥气”,因此,我国临床上治疗肝癌常有以黄连为君药的三黄汤及黄连解毒汤等的报道。这给了我们一个新的思路,用黄连提取物来研究对肝癌的影响是否能有新发现,而其机制也仍然需要我们进一步阐明。CD147,一种糖化免疫球蛋白中在肝癌内具高表达的超蛋白,已被确定为有前途的治疗癌症化疗的参考指标。体外研究表明,CD147可促进肿瘤浸润、转移及血管新生,抑制细胞凋亡和坏死并赋予癌细胞抵抗某些化疗的耐药性。最近的一项研究表明,CD147在肝癌中的细胞自噬和自噬性细胞死亡的抑制性调节中起了重要作用。然而,CD147是否参与黄连素抗肿瘤作用未见报道。因此,本课题拟研究黄连素是否诱导肝癌细胞的死亡以及黄连素诱导肝癌细胞死亡的分子机制,即CD147分子是否参与调节黄连素诱导的细胞死亡。我们采用不同浓度的黄连素诱导两种人肝癌细胞HepG2和SMMC7721,发现其出现自噬性死亡和凋亡,并从黄连素对CD147的作用方面探讨了自噬与凋亡的可能机制。自噬性细胞死亡是近年来新发现的另一型程序性细胞死亡方式。当细胞处于如饥饿、乏氧等恶劣环境时,可通过适度的自噬降解自身产物满足生存基本物质与能量需求;但过度自噬又将导致细胞自噬性死亡。新近有研究证实,肿瘤在无血管新生成之前期,乏氧肿瘤的环境亦可诱导肿瘤细胞产生自噬;黄连素可以通过Rho/ROCK途径来抑制肝癌细胞生长。这些都为我们研究抗肿瘤药物提供了新方向,即观察药物是否能促使肿瘤细胞引起自噬,以及是否能导致细胞最终发生自噬性死亡。本实验分为三部分:第一部分:黄连素抑制肝癌细胞细胞活性的时间依赖性和剂量依赖性的研究选取两种肝癌细胞(HepG2、SMMC7721),采用MTT法证实黄连素对两种肝癌细胞均具有细胞毒性作用。然后分别用0, 31.25, 62.5, 125, 250和500μM的不同浓度黄连素对HepG2和SMMC7721肝癌细胞处理24h,采用MTT法检测不同浓度下的肝癌细胞的活性变化。根据上述检测结果选取含有62.5μM浓度的黄连素的培养液分别处理两种肝癌细胞,在0,24,48,72和96 h后,采用MTT检测不同时间肝癌细胞的活性变化。结果表明,黄连素对HepG2和SMMC7721肝癌细胞在浓度为0, 31.25, 62.5 125, 250, 500μM及62.5μM浓度下培养0, 24, 48, 72, 96 h后具显著的时间依赖性和剂量依赖性。第二部分:黄连素诱导两种肝癌细胞自噬和凋亡的研究本实验分两个步骤:首先,运用荧光技术检测黄连素是否诱导肝癌细胞自噬以及用透射电子显微镜(TEM)检测自噬。1)我们选用SMMC7721肝癌细胞作为研究黄连素诱导肝癌细胞自噬的细胞模型。将pEGFP-LC3质粒转染到SMMC7721肝癌细胞,转染成功后,将细胞分为六个实验组,分别用0, 31.25, 62.5, 125, 250,500μM的黄连素培养24h,用荧光显微镜观察绿色的EGFP-LC3点状阳性细胞以证明黄连素诱导肝癌细胞发生自噬。研究表明,黄连素这种诱导肿瘤细胞自噬的现象是存在的,而且是剂量依赖性的;2)将SMMC7721和HepG2两种肝癌细胞分为对照组和黄连素处理组,采用0μM和500μM黄连素培养两种细胞24h,分别收集细胞,用透射电子显微镜检测自噬的特异性标志物—自噬泡的形成,结果显示:在黄连素处理组,发现大量自噬泡和凋亡小体共同存在,表明黄连素不仅诱导肝癌细胞发生了自噬而且诱导其发生了凋亡。接下来为了证明黄连素可以诱导肝癌细胞自噬性细胞死亡和凋亡,我们分别使用自噬特异性抑制剂3-methyladenine(3-MA)和凋亡的抑制剂z-DEVD-fmk,同时使用不增加抑制剂的对照,采用台盼兰染色的方法,计算细胞的死亡率。研究发现,这两种抑制剂都可以分别有效抑制黄连素诱导的细胞死亡。这进一步证明了黄连素既可以诱导肝癌细胞的自噬性细胞死亡,又可以诱导肝癌细胞的凋亡。第三部分:黄连素诱导肝癌细胞自噬性死亡与凋亡的分子机制已有的研究表明CD147在SMMC7721细胞中可以抑制饥饿诱导的自噬性细胞死亡,黄连素诱导肝癌细胞自噬性死亡与凋亡是否通过CD147的表达途经有待证实。实验分两个步骤:第一:通过Western Blot方法检测HepG2、SMMC7721肝癌细胞在不同浓度黄连素的作用下CD147分子的表达变化。结果表明随着黄连素浓度的提高,CD147表达呈明显降低趋势;第二,过表达CD147分子后检测黄连素对肝癌SMMC7721细胞死亡的变化。结果表明,过表达CD147的SMMC7721细胞中,细胞死亡明显下降。由此说明,黄连素可能通过下调CD147表达的途经诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡或细胞凋亡,这是相关研究的首次报道。本研究将为临床更好的治疗肿瘤提供新的潜在方法,同时也为中药的药理学研究提供新的理想范本。