【摘 要】
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抗菌肽是天然免疫系统的重要组成成分,参与机体对病原体的攻击和免疫应答的调节。生物体内合成的抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性。防御素是抗菌肽的一种,广泛分布于动物、植物和昆虫体内,对细菌、真菌、病毒等多种病原微生物具有较强的杀伤作用。目前,关于哺乳动物防御素抗病毒作用的研究虽然较多,但主要集中于抗囊膜类病毒的研究,抗无囊膜类病毒研究的较少。本课题主要将肠道病毒71型（enterovirus 71,
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抗菌肽是天然免疫系统的重要组成成分,参与机体对病原体的攻击和免疫应答的调节。生物体内合成的抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性。防御素是抗菌肽的一种,广泛分布于动物、植物和昆虫体内,对细菌、真菌、病毒等多种病原微生物具有较强的杀伤作用。目前,关于哺乳动物防御素抗病毒作用的研究虽然较多,但主要集中于抗囊膜类病毒的研究,抗无囊膜类病毒研究的较少。本课题主要将肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）作为无囊膜类病毒的代表,筛选EV71病毒刺激人结肠癌细胞HT29分泌的防御素,并初步检测人β-防御素3（human β-defensin 3,HBD3）对EV71是否具有抗病毒作用。本研究的主要内容包括三个方面:（1）EV71病毒刺激HT29细胞分泌防御素的筛选;（2）HBD3真核表达载体的构建及其转染后表达HBD3情况检测;（3）HBD3抗EV71作用初步检测。1、EV71病毒刺激HT29细胞分泌防御素的筛选该部分工作主要是先培养出EV71病毒的HT29细胞适应株,然后用该适应株（0.01 MOI）感染HT29细胞,通过RT-PCR的方法筛选出EV71刺激HT29细胞表达的防御素mRNA,然后通过基因克隆及测序的方法对筛选出的防御素进行鉴定。结果表明,EV71病毒可刺激HT29细胞表达HBD3 mRNA。2、HBD3真核表达载体的构建及其转染后表达HBD3情况检测利用PCR的方法获得含有信号肽序列的HBD3 cDNA片段（smHBD3）,通过基因工程操作将该片段连接至pcDNA3.1载体,经MluI、KpnI和EcoRI酶切鉴定及测序证明载体构建正确后,获得大量该质粒（pcDNA3.1-smHBD3）。将获得的质粒转染至HT29细胞,ELISA检测转染后不同时间内HBD3蛋白在细胞内、细胞外的分布及其表达总量。结果发现,在转染后24h即有HBD3表达;转染后36h有HBD3分泌至胞外;转染后72h,胞外HBD3的总量达到最高。3、HBD3抗EV71作用初步检测。本章主要通过转染的方法获得HBD3蛋白,再通过不同方案检测HBD3对EV71是否具有抗病毒活性。（1）在转染HT29细胞36h时,加入EV71病毒（0.01 MOI）感染细胞,并分别于病毒加入后的0h、12h、24h和36h收获病毒并测定病毒滴度;（2）通过转染的方法获得含有HBD3蛋白的混合物,将该混合物与EV71病毒（0.01 MOI）混合,于37℃作用4h,并用它们接种HT29细胞并培养48h,收获病毒,测定病毒滴度;（3）将获得的含有HBD3蛋白的混合物与EV71（0.01 MOI）一起培养HT29细胞4h,之后更换维持液培养HT29细胞48h,收获病毒,测定病毒滴度。三次独立重复试验结果表明,HBD3对EV71具有抗病毒活性,且抗病毒作用可能主要发挥于病毒进入细胞之前。本研究发现EV71可刺激HT29细胞表达HBD3 mRNA;HBD3蛋白对EV71病毒具有抗病毒活性,且主要在EV71进入HT29细胞之前发挥作用。新发现了一种能够抗无囊膜类病毒的防御素HBD3,并为今后研究HBD3抗EV71病毒作用的机制奠定了基础。
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