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目的：膀胱癌是泌尿系统常见的肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势且治疗后复发率较高。利用膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的基因治疗是一种很有前景的治疗策略。对于溶瘤腺病毒,除了肯定的药效学外,其毒性和安全性的问题也至关重要。目前关于膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的生物分布和安全性评价的报道还比较少。在临床前安全性评价中,获得腺病毒E1A基因在靶向器官组织以外的表达和分布的数据,对于评价利用溶瘤腺病毒进行基因治疗的风险十分关键。因此,本课题针对我们课题组构建的膀胱组织特异性溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UP Ⅱ-E1A (APU-E1A)和Ad-PSCAE-UP Ⅱ-E1A-AR (APU-E1A-AR),研究该系列病毒的扩增、纯化、鉴定,以及在裸鼠皮下移植瘤模型中的生物分布和近期安全性评价,为今后该溶瘤腺病毒进入临床试验治疗膀胱癌提供基本数据和理论依据。方法：我们利用膀胱组织特异性启动子UPⅡ启动溶瘤腺病毒E1A基因及E1A与雄激素受体AR的融合基因E1A-AR的表达,并在上游插入前列腺抗原增强子PSCAE增强UPⅡ的作用,构建了膀胱组织特异性溶瘤腺病毒APU-E1A和APU-E1A-AR。为了方便检测病毒在动物体内的复制,我们还利用萤火虫荧光素酶基因(LUC)构建了检测病毒Ad-PSCAE-UP Ⅱ-LUC (APU-LUC),通过LUC的检测实时观察病毒的复制情况。将得到的重组腺病毒在人胚肾293细胞(HEK293)中扩增,用氯化铯试剂盒进行纯化,用PCR的方法分别对溶瘤腺病毒中E1A、UP Ⅱ、PSCAE、AR, UP Ⅱ-E1A和UP Ⅱ-LUC各基因片段的表达进行鉴定,最后用TCIDso(50%组织培养感染病毒的剂量)的方法确定病毒的滴度。在前期试验已证实这些溶瘤腺病毒有效的基础上,我们利用人膀胱癌EJ细胞建立了裸鼠皮下移植瘤模型,并用不同剂量(5×107pfu,5×108pfu,5×109pfu)溶瘤腺病毒APU-E1A、APU-E1A-AR和APU-LUC进行瘤内注射。我们通过动物体重的测量、大体健康状况和行为学观察、血液中淋巴细胞百分比、血小板(platelet)数量及肝脏谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平的测定、各组织器官脏器系数的改变、宏观观察和H&E染色、免疫组化染色等实验研究溶瘤腺病毒对各组织器官的毒性反应。我们还通过提取注射溶瘤腺病毒APU-E1A、APU-E1A-AR后各组织器官中的E1A RNA及蛋白,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法和Western Blot方法分别检测E1A基因和蛋白的分布和表达,通过检测注射了APU-LUC的动物各主要器官中LUC的表达,检测病毒在动物各组织器官中的复制情况。结果：溶瘤腺病毒(APU-E1A, APU-E1A-AR)感染HEK293细胞后,出现了明显的细胞病变效应(CPE),确定了腺病毒的扩增反应；病毒纯化后OD260/OD280为1.2-1.24, TCID50/VP为0.98%-1%,最高感染滴度为1.2×1012IU/mL;溶瘤腺病毒中E1A、UP Ⅱ、PSCAE、AR, UP Ⅱ-E1A和UP Ⅱ-LUC基因的表达稳定。与注射了PBS的对照组动物相比,注射溶瘤腺病毒组的动物体重呈逐步上升趋势,大体健康状况和行为学观察未发现明显异常改变。注射了5×107pfu、5×108pfu及更高剂量5×109pfu溶瘤腺病毒APU-E1A及APU-E1A-AR的动物组,其血液学中淋巴细胞百分比、血小板数量无明显改变；注射5×109pfu溶瘤腺病毒动物组的肝脏转氨酶(AST,ALT)有轻微升高。通过解剖和大体观察未发现注射了溶瘤腺病毒动物的主要脏器如心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸、精囊腺、甲状腺、膀胱等器官有出血、坏死、肿大等异常现象,各组动物平均脏器系数与对照组相比统计没有显著性差异。动物主要脏器的H&E染色和针对腺病毒E1A的免疫组化染色结果表明溶瘤腺病毒APU-E1A、APU-E1A-AR只在膀胱移植瘤组织内复制和表达,在其他器官中没有复制和表达。qRT-PCR检测结果表明溶瘤腺病毒E1A基因主要在动物移植瘤组织中表达,在肝脏中有少量表达,在其他脏器中没有表达；Western Blot检测结果表明E1A蛋白只在动物移植瘤组织中表达,在其他组织脏器中未检测到明显表达；LUC在肿瘤组织中的活性较高,而在其他组织内较低,差异有统计学意义。结论：我们构建的膀胱组织特异性溶瘤腺病毒APU-E1A-AR和APU-E1A在HEK293细胞中的扩增方法可行,纯度、滴度符合要求；扩增后的溶瘤病毒中E1A、UP Ⅱ、PSCAE、AR, UP Ⅱ-E1A和UP Ⅱ-LUC基因的表达稳定。溶瘤腺病毒APU-E1A、APU-E1A-AR具有膀胱组织特异性,在5×107pfu和5×108pfu剂量瘤内注射裸鼠后,在动物的一般健康状况及行为学表现、血液学中淋巴细胞百分比及血小板的数量、肝脏转氨酶(AST,ALT)水平、各主要脏器的脏器系数及病理学表现、溶瘤腺病毒E1A基因及蛋白的表达水平中,未观察到明显毒性作用,相对安全。