目的：平滑肌22alpha（Smooth muscle22alpha，SM22α）是血管平滑肌细胞分化的标志蛋白之一，其在很多血管疾病，如动脉粥样硬化，血管再狭窄和腹主动脉瘤中表达下调。然而，SM22α的表达下调是主动参与了血管疾病的发生、发展，还是疾病进展过程中的被动表现，是一个未解的问题。利用转录组测序分析不仅可以发现疾病相关的生物功能和信号通路的富集基因，而且还可以发现新的靶分子。牛磺酸上调基因1（Taurineupregulated gene1, TUG1）的表达产物是一种长链非编码RNA（Longnoncoding RNA, lncRNAs），在细胞核和细胞质中均有表达。但是有关TUG1的确切功能和作用机制尚不清楚。方法：本文基于RNA-Seq技术，对SM22α基因敲除小鼠和其同窝野生型小鼠主动脉组织进行转录组测序及生物信息学分析和验证，旨在发现血管平滑肌细胞中SM22α相关的生物过程调控机制。探讨胞浆定位的TUG1的作用及其对血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell, VSMC）细胞骨架动力学的调节。结果：1SM22α基因敲除小鼠主动脉转录组测序分析1.1通过RNA测序产生的SM22α基因敲除小鼠与野生型小鼠血管差异表达基因选取基因表达量差异倍数在2倍及以上的基因为差异表达基因进行生物信息学分析。结果显示，在1398个差异表达的基因中，959（56.0％）基因表达上调，而439（25.6％）基因表达下调。大多数的差显基因是蛋白质编码基因，约315（18.4％）为未知/假设功能基因。随机选择12个基因进行定量RT-PCR验证，并对定量RT-PCR与RNA测序分析结果RNA倍数的变化进行了比较。在SM22α基因敲除所导致的差异表达基因中，血红蛋白（Hb）、载脂蛋白CI（ApoCI）和G0/G1开关基因2（G0s2）高度表达。其中基于FPKM值和改变倍数综合考虑分析，血红蛋白和载脂蛋白CI是SM22α基因敲除所引起的差异表达最显著的基因。1.2差异表达基因的GO分析GO分析显示，差异表达基因所定位的亚细胞间区多与细胞膜、突触、胞外区和细胞交界处相关。GO生物过程分析发现，这些差异表达基因主要与信号转导、发育、物质运输和细胞通讯等过程相关。GO分子功能分析结果显示，这些基因的编码产物主要是配体、酶、受体和结构蛋白。1.3差异表达基因的PANTHER分析使用PANTHER软件对差异表达基因编码的蛋白进行分类。结果显示，差异表达基因编码的蛋白在“受体”类型中富集最多，这与前面的GO分子功能分析结果非常相似。对“受体”进行再分类，结果显示为“G蛋白偶联受体”和“细胞因子受体”为最主要的两大类受体。差异表达的基因在“G蛋白偶联受体”中包括的基因主要与细胞增殖和血管平滑肌细胞迁移功能相关。差异表达的基因在“细胞因子受体”这一类蛋白分类中，主要与协调免疫和炎症反应方面的功能相关。1.4差异表达基因的信号通路分析使用KEGG、BioCarta和IPA分别进行信号通路分析。KEGG中富集的通路，包括神经活性配体-受体相互作用、造血细胞系和细胞因子，细胞因子受体相互作用。在BioCarta信号通路分析中富集的通路为与造血有关的细胞因子、参与脂质代谢和毒性核受体和细胞因子调节炎症反应。IPA经典途径分析结果显示，差异表达基因在LXR/RXR激活、动脉粥样硬化信号途径、先天和适应性免疫细胞间信号传导、树突状细胞成熟、T细胞和B细胞分泌途径、钙和肌萎缩性侧索硬化症等信号途径富集。总体而言，KEGG、BioCarta和IPA分析均表明，造血细胞因子、炎症和脂质代谢是SM22α基因缺失激活的最主要的三个信号通路。1.5差异基因的转录因子和调控网络分析使用IPA转录因子分析功能可以鉴定差异基因数据集中发生显著变化的基因的上游转录因子。IPA转录因子分析结果表明，SM22α基因敲除后有6个转录调节因子被激活或抑制：RELA/NF-κB、KLF2、RXRα、PPARα、JUN和NUPR1。其中，TNF可被NF-κB、RXRα、JUN和KLF2调控。CXCR4可由NF-κB、KLF2和NUPR1激活。这些结果表明，SM22α基因缺失可导致炎症调节途径的激活。差异表达基因的IPA潜在调控网络分析发现存在10个基因调控网络，涉及的主要生物学功能有：参与细胞信号传导、脂质代谢和心血管疾病。而通过IPA分析差异基因所导致的下游生物学效应，即疾病和功能分析，显示SM22α基因缺失所导致的疾病过程和生物学功能主要与动脉粥样硬化、低血压、动脉闭塞、血管和动脉疾病相关。2转录组测序分析结果的验证：SM22α缺失促进了血管疾病的发生2.1IPA分析差异基因所导致的下游生物学效应和信号通路分析通过IPA分析差异基因所导致的下游生物学效应，即疾病和功能分析，显示SM22α基因缺失所导致的疾病过程和生物学功能主要与动脉粥样硬化、动脉硬化、低血压、动脉闭塞、血管和动脉疾病相关。其中，有45个基因在动脉粥样硬化疾病中富集，推测SM22α基因缺失后可能已经启动了早期的动脉粥样硬化疾病分子的改变。我们选取这些富集基因中的与早期炎症（TNF和IL-18）和脂代谢（LPL、ApoAII、Adiponectin和ApoCI）相关的基因在SM22α基因敲除和其野生型小鼠的主动脉中进行RT-PCR验证。结果显示，SM22α基因缺失后TNF、IL-18、LPL、ApoAII和ApoCI表达均显著上调，而Adiponectin表达水平则显著下降。证明动脉粥样硬化早期相关基因与SM22α有着明显的相关性。早期的动脉粥样硬化实际上是炎症反应，其中NF-κB是关键的炎症反应分子。在SM22α基因敲除小鼠中，TNF mRNA水平表达明显上调。信号通路分析进一步显示，TNF的表达上调激活了NF-κB信号通路的活化。2.2敲低SM22α促进TNF-α诱导的IκBα磷酸化和总IκBα的降解利用Western blot分析检测敲低SM22α后对IκBα磷酸化的影响。结果显示，处于静止期的VSMCs中，IκBα磷酸化水平很低。给予TNF-α刺激或者敲低SM22α后，IκBα的磷酸化水平均明显升高，总IκBα水平显著降低（P<0.05）。敲低SM22α后再给予TNF-α (10ng/mL)刺激15min，与对照组和单独TNF-α刺激相比，IκBα磷酸化水平的升高和总IκBα水平的降低均更明显（P<0.05），说明敲低SM22α可以诱导IκBα的磷酸化，加速总IκBα的降解，进而促进TNF-α介导的NF-κB p65的活化。2.3敲低/过表达SM22α增强/抑制TNF-α诱导的NF-κB p65活化与核转位为了确定SM22α和TNF-α介导的NF-κB信号通路的活化之间的关系，我们采用SM22α特异性小干扰RNA（siSM22α）转染VSMC，观察敲低SM22α后对TNF-α诱导的NF-κB活化和核转位的影响。Western blot分析结果显示，静止期VSMC中NF-κB p65主要在细胞胞浆中表达，而细胞核中的表达水平较低。给予TNF-α刺激或者敲低SM22α后，细胞核中的NF-κB p65水平显著上调；敲低SM22α后再给予血管平滑肌细胞TNF-α (10ng/mL)刺激15min，结果表明，NF-κB p65核转位水平明显高于对照组（P<0.05）。上述实验结果表明，敲低SM22α增强了TNF-α诱导的NF-κB p65活化与核转位。为了进一步验证SM22α在TNF-α诱导的VSMC炎症应答中的作用，利用SM22α腺病毒表达载体转染使SM22α在VSMC中过表达，观察其对NF-κB活化及核转位的影响。Western blot分析结果显示，给予TNF-α刺激后，与单独TNF-α刺激相比，过表达SM22α可抑制TNF-α诱导的NF-κB p65核转位。上述结果表明，过表达SM22α可抑制TNF-α诱导的NF-κB p65激活。2.4SM22α基因缺失导致ApoCI表达水平升高动脉粥样硬化疾病发生时除炎症外，另一个事件就是脂质沉积。有研究表明ApoCI在心血管疾病脂质代谢过程中起到一个节点作用。RNA测序结果显示SM22α基因缺失后，ApoCI mRNA表达水平升高。我们随后又在SM22α基因敲除和野生型小鼠的胸腹主动脉中检测了ApoCI蛋白的表达水平，Western blot分析结果显示，ApoCI在SM22α基因缺失小鼠中表达水平升高；采用SM22α特异性小干扰RNA（siSM22α）转染血管平滑肌细胞后，结果显示，敲低SM22α后可促进ApoCI的表达。免疫组织化学染色法分别检测ApoCI在SM22α-/-和SM22α+/+小鼠颈动脉中的表达情况。结果显示，ApoCI在SM22α-/-和SM22α+/+小鼠颈动脉中均有表达，且在SM22α-/-小鼠颈动脉中的表达水平显著高于对照野生型小鼠；为了检测ApoCI在血管疾病中的表达情况，采用颈总动脉结扎模型，免疫组化显示ApoCI在SM22α-/-小鼠中的表达量也明显高于野生对照结扎组。为了检测SM22α基因的缺失是否也影响了血脂水平，分别取禁食8-12h的SM22α-/-和SM22α+/+小鼠血清检测血清中的胆固醇和甘油三酯。结果表明，SM22α-/-小鼠中的甘油三酯水平高于野生型，而总胆固醇水平则低于野生型小鼠。2.5SM22α基因缺失小鼠易于发生血管疾病为了检测SM22α基因缺失后是否影响了血管细胞的黏附和迁移，我们采用免疫组织化学染色法分别检测细胞黏附和迁移相关分子的表达，包括MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9的表达。结果表明，与野生型相比，在SM22α-/-小鼠血管中，ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9表达水平均明显上调，而MCP-1表达水平在两种血管中无明显变化。为了检测SM22α基因缺失小鼠是否易于发生血管疾病。我们利用血管结扎模型对SM22α-/-和SM22α+/+小鼠一侧颈总动脉进行结扎。结果显示，与对照组相比，SM22α-/-小鼠在结扎的第14天血管内膜明显增厚。上述实验结果表明，SM22α基因的正常表达对于维持血管稳态来说是必须的，缺失该基因的小鼠则易于发生血管疾病。3长链非编码RNA TUG1参与EZH2介导的α-actin的甲基化促进VSMC皮层细胞骨架的形成3.1大鼠中存在长链非编码RNA TUG1通过序列比对和同源性分析，预测得到大鼠TUG1基因位于大鼠14号染色体上，在基因组上也与MORC family CW-type zinc finger2基因相邻。通过PCR扩增出大鼠TUG1RNA基因4612bp的全长片段，序列分析显示大鼠TUG1基因和小鼠一样均含有4个外显子，而人TUG1基因则含有3个外显子。大鼠TUG1与小鼠和人序列一致性分别为93.0%和75.5%。Real-timePCR结果显示，血清饥饿诱导体外培养的VSMC后，TUG1表达水平降低。证实大鼠VSMC表达TUG1。3.2胞浆EZH2与细胞皮层F-actin形成相关以往研究认为EZH2主要存在于细胞核中，胞浆中也存在表达且与细胞伪足的形成有关。Western blot结果显示，与增殖VSMC相比，血清饥饿72h诱导VSMC分化后，EZH2表达下降；EZH2在VSMC细胞核及胞浆中均有分布，并且血清饥饿诱导VSMC分化后，EZH2在胞浆中的表达减少。免疫荧光分析显示，在胞浆中的EZH2部分与细胞边缘部位F-actin共定位。结果表明，在VSMC胞浆中高表达的EZH2可能参与了VSMCs细胞皮层骨架的形成过程。3.3非编码RNA TUG1与EZH2、α-actin存在相互作用，TUG1敲低后促进EZH2出核为了验证VSMCs中TUG1/EZH2/α-actin是否存在相互作用，进行RNApull down实验。其结果初步显示，体外合成生物素标记的TUG1RNA探针可与EZH2和α-actin存在相互作用而其反义链探针不能检测该作用，证明在VSMCs中非编码RNATUG1与EZH2、α-actin存在相互作用。Western blot和细胞免疫荧光结果均显示，敲低TUG1后促进EZH2出核，导致EZH2胞浆定位增多。该变化与PDGF刺激VSMC作用相似。3.4TUG1/EZH2介导的α-actin甲基化参与细胞皮层F-actin的形成为了确定TUG1是否对F-actin介导的细胞骨架动力学产生影响，敲低TUG1后，分步提取G-actin和F-actin。Western blot结果显示，敲低TUG124h后，F-actin/G-actin比值下降，表明皮层细胞骨架动力学有赖于TUG1。通过蛋白甲基化位点预测软件PLMLA及序列分析显示，α-actin分子中存在多个赖氨酸甲基化潜在位点，其中193位赖氨酸甲基化位点发生甲基化的可能性最大。为了揭示TUG1、EZH2和α-actin三者相互作用的意义，利用赖氨酸甲基化抗体进行免疫沉淀。结果显示，α-actin可以发生赖氨酸甲基化，敲低TUG1后其甲基化程度减少，伴随F-actin的解聚。表明TUG1与EZH2的结合可使α-actin甲基化，后者促进F-actin的聚合，参与皮层细胞骨架的形成。结论：1SM22α基因敲除后引起的上调基因数目远远大于下调的基因数目，差异表达的基因编译的蛋白主要是位于细胞膜上的G-蛋白偶联受体；造血细胞因子，炎症和脂质代谢是SM22α基因缺失激活的最主要的三个信号通路；SM22α基因敲除后RELA/NF-κB被激活。2SM22α基因敲除小鼠血管细胞细胞黏附和迁移分子活性增强，是一种早期血管炎症模型。3大鼠血管平滑肌细胞表达长链非编码RNA TUG1。胞浆TUG1与EZH2、α-actin存在相互作用，TUG1/EZH2介导的α-actin甲基化参与了细胞皮层F-actin的聚合。