研究背景恶性肿瘤的治疗是一个世界性难题,大多数肿瘤患者因复发、耐药和远处转移导致治疗失败。研究表明,异质性肿瘤组织中存在很少一部分具有干细胞特性的细胞亚群,它们在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及耐药中起着十分重要的作用,被称为“肿瘤干细胞”(Cancer stem cells)或“肿瘤干细胞样细胞”(Cancer stem-like cells)。准确地将其分离出来对研究肿瘤干细胞的生物学特性以及靶向肿瘤诊断与治疗具有十分重要的意义。因而,针对肿瘤干细胞分选策略的研究受到越来越多地关注,包括:采用肿瘤干细胞相关的表面标志物(如:CD133、CD44、ALDH、EPCAM等)进行分选与鉴定;通过无血清悬浮培养的方法富集肿瘤干细胞样细胞;分选出的侧群细胞(Side Population)具有肿瘤干细胞的特性,然而,由于肿瘤干细胞的生物学行为复杂多变,异质性较大,且表面标记物易受环境影响而发生改变,导致以上方法缺乏特异性,分选效率低,重复性差。新近研究表明,肿瘤干细胞可自发荧光,其线粒体数量、线粒体膜电位与普通肿瘤细胞不同,因此,发展一种针对肿瘤干细胞自身功能活性的分选新策略,有望为肿瘤干细胞的靶向治疗研究提供新的理论认识和潜在技术手段。糖酵解是肿瘤细胞最基本的代谢方式和主要供能途径,同时,它可影响肿瘤相关基因的表达、生物合成、肿瘤细胞的增殖和分化,甚至决定肿瘤细胞的命运。研究表明,缺氧条件下,肿瘤细胞的缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor)表达上调,被认为是驱动肿瘤细胞代谢事件的关键因子,它是调控肿瘤细胞向糖酵解表型转变和维持肿瘤细胞相关特性的重要因素。并且,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通过参与多种信号调控通路而直接调控肿瘤干细胞相关功能。因此,通过靶向肿瘤干细胞的代谢活性和相关信号调控通路对肿瘤干细胞功能的认识和发展新的分选策略具有十分重要的前景。深入探讨肿瘤干细胞的代谢特征和相关信号调控通路,为靶向和分选肿瘤干细胞提供了新的理论基础。本研究基于IR-780对肿瘤干细胞样细胞亚群具有识别能力的特点,采用流式细胞分选技术将荧光信号强弱不等的两亚群细胞(IR-780~H,IR-780L)分选后进一步对其生物学特性进行鉴定。结果表明,IR-780~H细胞亚群具有肿瘤干细胞相关特性:较强的自我更新能力、克隆形成能力、侵袭转移、耐药及成瘤能力。机制研究表明,HIF-1α/糖酵解通路及其下游线粒体内膜上转运蛋白ABCB10的活性在介导IR-780摄取中发挥重要作用。综上所述,本研究针对肿瘤干细胞样细胞亚群内在的代谢特征发现七甲川花菁染料IR-780可以识别并分选肿瘤干细胞样细胞亚群,建立了一种不依赖表面标志物的分选新方法,为我们准确分离鉴定肿瘤干细胞和发展肿瘤靶向治疗策略提供新的研究手段。主要研究内容包括三部分:1、细胞分选:体内外实验研究七甲川花菁染料IR-780对肿瘤的靶向性,在此基础上,研究IR-780对异质性肿瘤细胞的识别作用;优化染色条件采用1.25μM IR-780于37℃孵育肿瘤细胞15min后通过流式细胞仪(650nm激发波和780nm发射波)将荧光信号最强的5%亚群细胞分选出来。同时与荧光信号较低的5%亚群细胞(分别命名为IR-780~H和IR-780L细胞)比较无血清成球能力。2、干性鉴定:采用1.25μM IR-780标记肿瘤细胞后分选出两亚群细胞,通过体外实验研究IR-780~H细胞的自我更新能力、细胞周期分布、侵袭能力、耐药性及干细胞标志物NANOG,OCT4,SOX2、ALDH、EPCAM的表达水平;体内实验通过NOD-SCID小鼠皮下荷瘤实验研究IR-780~H细胞亚群的致瘤能力。3、机制研究:首先,在激光共聚焦下观察IR-780的亚细胞定位;其次,研究IR-780~H细胞的代谢活性对IR-780摄入的影响;再次,质谱鉴定出线粒体内膜上的转运蛋白ABCB10对肿瘤干细胞样细胞摄取IR-780的影响;最后,ChIP实验研究ABCB10与HIF-1α的的调控关系。结果:1、本实验在课题组前期研究的基础上进一步发现七甲川花菁染料IR-780在体内外对质性肿瘤细胞具有不同的识别能力,其中对一小部分肿瘤细胞(约5%)具有更强的识别能力。为了研究这群肿瘤细胞的生物学特性,我们优化染色条件采用1.25μM IR-780于37℃孵育肿瘤细胞15min后,通过流式细胞仪(650nm激发波和780nm发射波)将荧光信号最强的5%亚群细胞(IR-780~H细胞)分选出来与荧光信号较低的5%亚群细胞进行比较,结果证实IR-780~H细胞具有更强的无血清成球能力。2、体内外实验研究发现,IR-780~H细胞较IR-780L细胞具有更强的增殖能力,可形成更多、更大的细胞克隆,大多数IR-780~H细胞停滞在静息的细胞周期,其中约62%处在G1期;RT-PCR和Western blotting结果表明IR-780~H细胞高表达多潜能相关的干性基因NANOG、OCT4、SOX2及肿瘤干细胞表面标志物ALDH、CD44、CD133和EPCAM。同时,IR-780~H细胞具有更强的耐药和侵袭转移能力,在NOD-SCID小鼠体内具有更强的致瘤能力。以上结果说明IR-780~H细胞具有肿瘤干细胞样细胞的特性。3、进一步机制研究证实IR-780特异性蓄积于肿瘤细胞线粒体中,两亚群细胞的线粒体数量没有差异;但IR-780~H细胞自身高活性的HIF-1α/糖酵解调控通路是介导IR-780特异性蓄积的主要原因;进一步研究证实线粒体内膜上的转运蛋白ABCB10是介导IR-780进入肿瘤细胞线粒体的主要分子,最后,ChIP实验证实HIF-1α通过与ABCB10启动子区域直接结合调控其表达水平。综上所述,HIF-1α/糖酵解通路及其下游线粒体内膜上转运蛋白ABCB10的活性是介导肿瘤干细胞样细胞亚群摄取IR-780的主要原因。结论:本研究首次发现IR-780可用于肿瘤干细胞样细胞的分选,通过对肿瘤细胞亚群高摄取IR-780的机制研究,结果表明HIF-1α/糖酵解通路及其下游线粒体内膜上转运蛋白ABCB10的活性是介导IR-780摄取的主要原因。这一新的分选策略为临床肿瘤靶向治疗研究提供了新的理论依据和潜在技术手段。