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第一部分SOCS3基因转染对小鼠同种异体主动脉移植物慢性排斥反应的作用和机制目的：构建小鼠同种异体主动脉移植模型,模拟人类心脏移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy, CAV)病理变化。利用携带小鼠细胞因子信号抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3, SOCS3)基因的重组腺病毒载体全身转染,观察SOCS3基因对移植物慢性排斥反应的影响,并探讨其机制。方法：取供体Balb/c小鼠主动脉,对受体C57b1/6小鼠,行同种异体主动脉移植。81只C57bl/6小鼠腹主动脉移植受体随机分为3个组：1.对照组,2.Ad-SOCS3组,3.Ad-GFP组。分别于术后24小时经受体尾静脉注射100μl无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)、1×109pfu编码SOCS3基因的腺病毒载体和1×109pfu空白腺病毒载体。将每组3只小鼠,分批于转染后第1、3、5、7、14天处死,获取动脉移植物,同时以正常C57b1/6小鼠主动脉作为对照,采用实时定量逆转录酶聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测SOCS3mRNA表达的变化。转染后第3天另取3只小鼠,取动脉移植物、肝脏、脾脏、心脏,冰冻切片置于荧光显微镜下观察全身转染效果。每组9只小鼠于术后第8周处死,获取动脉移植物,用于组织学检查、RT-PCR、Western blotting检测,获取脾脏,用于流式细胞术检测。其中RT-PCR和Western blotting检测SOCS3、STAT3、IFN-γ、T-bet、IL-10、GATA-3、iNOS、CXCL-10、Arg-1、Fizz1、VCAM-1基因和蛋白表达；Western blotting检测P-STAT3蛋白表达；动脉移植物行组织病理学切片,HE染色,测量移植动脉狭窄率；CD11b和CD4免疫组织化学染色,分别计数浸润巨噬细胞和CD4+T淋巴细胞。流式细胞术检测脾脏CD4+T-bet+/单核细胞和CD4+GATA-3+/单核细胞比率。结果：1.Ad-SOCS3组,移植物内SOCS3mRNA于转染后第1天即可检测到高水平表达,此后逐渐上升,转染后第5天达到高峰,之后随时间推移逐渐下降,转染后14天仍可检测到SOCS3mRNA高表达。而对照组及Ad-GFP组移植物内SOCS3mRNA表达均明显低于同时间点Ad-SOCS3组。2.三组移植动脉内膜均增厚,对照组和Ad-GFP组移植动脉内膜增厚更加明显,管腔面积较Ad-SOCS3组显著减少,移植动脉狭窄率明显高于Ad-SOCS3组。3.三组小鼠动脉移植物均有炎性细胞浸润。Ad-SOCS3组移植动脉内膜巨噬细胞和CD4+T淋巴细胞数均较其他两组明显减少。4.与对照组和Ad-GFP组相比,Ad-SOCS3组STAT3、IFN-γ、T-bet、iNOS、 CXCL-10、VCAM-1基因和蛋白表达水平明显下调,P-STAT3蛋白水平明显下调,SOCS3、IL-10、GATA-3、Arg-1、Fizzl基因和蛋白表达水平明显上调。5.与对照组和Ad-GFP组相比, Ad-SOCS3组脾脏CD4+T-bet+/单核细胞比率明显降低,CD4+GATA-3+、单核细胞比率水平明显升高。结论：成功建立小鼠同种异体主动脉移植模型后,受体小鼠产生对移植动脉的排斥反应。利用小鼠SOCS3基因重组腺病毒载体,可有效转染并使受体小鼠动脉移植物内SOCS3高表达。SOCS3基因过表达可抑制受体移植动脉内膜增生和管腔狭窄,在小鼠同种异体腹主动脉移植物慢性排斥反应中发挥保护性调节作用。这一效果可能与抑制JAK/STAT信号通路激活,调节局部及全身免疫反应,减少局部巨噬细胞和CD4+Th细胞浸润,降低M1型、Thl型促炎性炎症因子基因和蛋白表达水平,上调M2型、Th2型促炎性炎症因子基因和蛋白表达水平有关。其中SOCS3基因对巨噬细胞和CD4+Th细胞的免疫活性调节作用及机制有待进一步研究。第二部分SOCS3基因转染对小鼠巨噬细胞和Th细胞免疫反应活性的影响和机制目的：为了进一步研究SOCS3基因对慢性排斥反应中的主要效应细胞——巨噬细胞和Th细胞的免疫反应活性的影响和机制,我们在体外用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)分别刺激诱导小鼠巨噬细胞极化、CD4+Th细胞分化,观察SOCS3基因转染对其主要亚群分化和炎症细胞因子表达的影响,并探讨其机制。方法：分别分离并培养C57b1/6/、鼠外周血来源巨噬细胞和脾脏来源CD4+Th细胞。实验分为3组：对照组、Ad-SOCS3组和Ad-GFP组,分别以PBS、小鼠SOCS3基因重组腺病毒载体和空白腺病毒载体转染小鼠巨噬细胞。转染成功后,分别以浓度10ng/ml LPS刺激激活小鼠巨噬细胞24小时,诱导其极化,以10μg/ml PHA刺激小鼠CD4+Th细胞48h,诱导其分化。收集细胞,采用RT-PCR和Western blotting检测巨噬细胞SOCS3、STAT3、iNOS、TNF-α、IL-6、CXCL-10、Arg-1、Fizzl、CCL-22、TGF-β, CD4+Th细胞SOCS3、T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2、GATA-3、IL-4、IL-6、 IL-10、STAT6基因和蛋白表达；Western blotting检测巨噬细胞P-STAT3蛋白表达；免疫荧光技术(immunoflurescense assay, IFA)分别检测巨噬细胞iNOS、Arg-1和CD4+Th细胞IFN-γ、IL-10蛋白表达；流式细胞术检测CD86+、CD80+、T-bet+、GATA-3+细胞亚群百分比。结果：1.巨噬细胞的最佳转染条件为：感染复数(multiplicity of infection, MOI)=80,转染时间48小时。CD4+Th细胞的最佳转染条件为：MOI=160,转染时间72小时。2.Ad-SOCS3组与对照组和Ad-GFP组相比较,Ad-SOCS3组巨噬细胞STAT3、iNOS、 TNF-α、IL-6、CXCL-10, CD4+Th细胞T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2基因和蛋白表达,以及巨噬细胞P-STA3蛋白表达明显下调,巨噬细胞SOCS3、Arg-1、 Fizzl、CCL-22、TGF-β, CD4+Th细胞SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因和蛋白表达明显上调。3.免疫荧光结果显示,与对照组和Ad-GFP组相比较,Ad-SOCS3组巨噬细胞iNOS蛋白表达明显下调,显色低,而Arg-1蛋白表达明显上调,显色高。CD4+Th细胞IFN-γ蛋白表达明显下调,显色低,而IL-10蛋白表达明显上调,显色高。4. Ad-SOCS3组与对照组和Ad-GFP组相比较, CD86+、T-bet+细胞亚群百分比减少,CD80+、GATA-3+细胞亚群百分比增加。结论：在本实验中,通过重组腺病毒载体转染的方式,使小鼠巨噬细胞和CD4+Th细胞SOCS3基因过表达,可在体外刺激诱导分化的过程中,抑制巨噬细胞M1型极化和Th细胞Thl型分化,促进巨噬细胞M2型极化和Th细胞Th2型分化。这一结果与动物模型实验结果一致。其原因为SOCS3基因过表达通过抑制AK/STAT信号通路激活,抑制M1型巨噬细胞极化、Thl细胞分化,下调其炎症反应活性及促炎性细胞因子表达。而JAK/STAT信号通路的竞争性抑制和Thl型细胞因子表达下调,可能间接性减弱了对M2型巨噬细胞极化和Th2细胞分化的抑制作用,一定程度上促进巨噬细胞M2型极化和Th细胞Th2型分化。体外实验阐明了SOCS3基因对小鼠同种异体主动脉移植物的保护作用,可通过调节小鼠巨噬细胞和CD4+T细胞主要亚群分化和炎症细胞因子表达实现。为心脏移植术后慢性排斥反应和移植物血管病的临床治疗提供新思路。