研究目的1.制备携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3,并鉴定其在体外能否发挥生物学活性。2.探讨制备与纯化凋亡素蛋白多克隆抗体的方法,并对纯化后抗体的有效性和特异性进行免疫学评价。3.探讨并分析重组腺相关病毒rAAV-VP3对人膀胱癌细胞的感染特点、体外抑制膀胱癌效应及其可能的作用机理。4.评价携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗作用与效果,并对其作用机理进行探讨。研究方法1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析：将VP3基因通过基因重组的方法克隆至pAAV-MCS载体中,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后将其与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-VP3。收获病毒后采用氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠沉淀-氯仿抽提3个步骤进行病毒的分离、浓缩和纯化；PCR扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒的包装是否成功。病毒液负染后透射电镜观察病毒颗粒,并用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV-VP3的物理滴度；利用RT-PCR检测感染重组病毒后VP3基因在Vero细胞中的转录,免疫荧光检测VP3蛋白在Vero细胞中的表达。2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价：用真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经Nde I/BamH I双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72h后行免疫荧光.Western blot检测,对抗体的特异性进行免疫学评价。3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用：利用MTT法检测凋亡素重组腺相关病毒对T24、EJ细胞的MOI值及其对膀胱癌细胞增殖的影响；RT-PCR检测凋亡素在T24、EJ细胞中的转录,Western Blot检测凋亡素蛋白在膀胱癌细胞中的表达；透射电镜、DNA Ladder法观察和判定膀胱癌细胞凋亡；流式细胞术PI法检测重组病毒对膀胱癌细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI双染法检测感染重组病毒后T24、EJ细胞的凋亡；Western Blot检测凋亡素对膀胱癌细胞中的Survivin表达的影响；Elisa检测凋亡素对膀胱癌细胞凋亡通路中caspase-3的激活作用。4.凋亡素重组腺相关病毒对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗评价：建立荷人膀胱癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,将动物随机分为未治疗组、对照病毒rAAV-EGFP组、丝裂霉素C(MMC)治疗组、rAAV-VP3治疗组共4组,病毒组注射剂量为1×1010v.g./50μl/只,MMC用量1mg/kg,均采用瘤周及瘤内多点注射法。通过绘制皮下移植瘤生长曲线、计算平均瘤重和抑制率、大体观察和病理组织学检查观察凋亡素重组腺相关病毒对Balb/c裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,通过观察各组裸鼠治疗过程中一般情况、各组裸鼠存活率的比较评价治疗效果。免疫组化染色观察注射重组病毒后VP3蛋白在瘤内的表达时效性,免疫组化法计数阳性细胞所占百分比观察rAAV-VP3治疗组与对照病毒rAAV-EGFP组Ki.67、C-erbB-2、Rb、nm23的表达差异。实验结果1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析：重组质粒pAAV-VP3经酶切鉴定和基因测序正确,三质粒共转染AAV-293细胞72小时后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,收获的重组病毒纯化后滴度为5.1×1011v.g./ml,电镜下可见病毒颗粒。感染Vero细胞后,可检测到VP3基因的转录和蛋白表达。2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价：原核表达载体pET8a-VP3的构建成功并经PCR鉴定和基因测序正确；原核表达菌株pET8a-VP3/BL21经终浓度为0.4mM的IPTG诱导4小时后在14.4kDa与20kDa之间出现目的条带,其大小与预期结果相符合,外源蛋白成功表达；收集洗脱峰,SDS-PAGE检测VP3蛋白纯度良好,无明显杂带。用纯化后的VP3蛋白免疫新西兰大耳白兔后抗血清效价可达1：243000,采用Protein A纯化总IgG, SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体纯度较高,无明显杂带,间接ELISA法检测抗体灵敏度为5.4ng/ml;将rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72小时后行免疫荧光检测,可见特异性内源性表达的VP3蛋白以及核定位效应。在EJ和T24细胞中凋亡素主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质,行Western blot检测,于接近14kDa处可见特异性的目的条带。3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用：MTT法显示以MOI值2.0×104v.g./cell、1.0×105v.g./cell、2.0×105v.g./cell、5.0×105v.g./cell、1.0×106v.g./cell分别感染T24细胞和EJ细胞后72h, MOI=5.0×105v.g./cell时rAAV-VP3对T24细胞和EJ细胞的杀伤效应最为明显,增加感染复数不能进一步增强rAAV-VP3对膀胱癌细胞的杀伤效应；感染重组腺相关病毒rAAV-VP3的T24、EJ细胞增殖活性均明显下降,且随时间的推移效果更明显,而细胞对照组和rAAV-eGFP的OD490值都逐渐小幅上升,60h以后则逐渐下降(P<0.01)。透射电镜观察膀胱癌细胞出现核固缩、凋亡小体等典型的凋亡形态学改变,DNA Ladder法显示在100bp左右形成断裂的DNA片段；通过RT-PCR和Western Blot可检测到重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后能在T24、EJ细胞中转录与表达；流式细胞术PI法检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后与对照组比较S期细胞比例降低和G2M期细胞比例增多(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法检测到感染rAAV-VP3后T24、EJ细胞发生凋亡的比例明显升高。Western Blot检测腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,而对照病毒rAAV-LacZ作用的T24、EJ细胞内源性Survivin为高表达状态。Elisa法检测感染第3d、4d、5d后T24和EJ细胞中激活型caspase-3的含量明显增高,与对照病毒组和细胞对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,有较高的肿瘤抑制率并能提高裸鼠的存活率,生存中位数时间为55天,瘤内注射重组腺相关病毒rAAV-VP3后,可以观察到VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,于21天左右达到顶峰,以后一直维持强阳性表达；免疫组化检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3可抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并能上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达。结论1.包装的重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性。2.制备的凋亡素蛋白多克隆抗体具有较强的灵敏度和特异性,证实了凋亡素在正常细胞中定位于细胞质,而在肿瘤细胞中则定位于细胞核。3.重组腺相关病毒rAAV-VP3对T24、EJ细胞的最适感染复数为5.0×105v.g./cell,感染rAAV-VP3后膀胱癌细胞的增殖受到抑制,主要作用于肿瘤细胞的S期和G2/M期,发生G2/M期阻滞,引起细胞DNA合成受阻和降解。腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,提示VP3与Survivin的存在拮抗性,可能是凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一；caspase-3的激活是凋亡素诱导的细胞凋亡通路中的关键分子信号之一4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,并能减少肿瘤对周围组织的侵犯与瘤栓形成。基因治疗后能提高裸鼠的存活率,与MMC治疗组相比具有一定的优越性。其介导的VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,凋亡素体内抑制膀胱癌的作用机制可能与其抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达有关。5.利用腺相关病毒介导凋亡素基因的表达治疗膀胱癌的策略可行,为下一步运用该重组腺相关病毒进行临床前研究奠定了基础。