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木聚糖酶是最重要的半纤维素酶,应用领域广泛,但不同领域需求不同性质的木聚糖酶。挖掘不同性质的木聚糖酶,并按用途通过蛋白工程对其进行改良意义重大。参考耐热真菌Talaromyces leycettanus JCM12802、嗜酸真菌 Bispora sp.MEY-1 以及高效木质纤维素降解菌Gloeophyllum trabeum CBS 900.73的基因组信息,获得了不同性能的木聚糖酶,再利用计算机辅助设计改良酶的性能并初步探究改良的机制。从三株真菌的基因组序列中筛选出六个糖苷水解酶GH10家族和一个GH11家族的木聚糖酶基因,进行性质研究。其中,四个木聚糖酶(TlXyn1OA、TlXyn11B、Xyl10E和GtXyn10)性质良好。TlXyn1OA的最适pH为4.5,最适温度为80℃,热稳定性优良,于85℃,90℃和95℃处理一小时后,分别保持81.7%,74.8%和58.2%的酶活力;TlXyn11B的最适pH为3.5,最适温度为65℃,比活力高达8300±32 U/mg;Xyl1OE的最适pH为4.0,最适温度为95℃,可能是目前最嗜热的真菌木聚糖酶;GtXyn10最适pH 4.5,最适温度75℃,同时具有木聚糖和大麦葡聚糖的活性。四个酶都有非常大的工业应用潜力。高比活的TlXyn11B不能耐受70℃以上的高温,需要热稳定性改良。GH11木聚糖酶的N端对热稳定性有重要影响。本研究采用饱和突变优化N端序列。两轮突变后,获得了热稳定性提高、比活力相当的突变体5个(S3F、S3F/D35V、S3F/D35Q、S3F/D35I和S3F/D35M),Tm值提高了 2.3-7.8℃。分子动力学模拟分析表明TlXyn11B、S3F和S3F/D35I的N端分别形成了不一样的局部构象;其中,S3F/D35I的氨基酸相互作用网络更密集,形成了利于N端稳定的Ser45-Phe3-Thr47/Ile35夹心结构。以榉木木聚糖为底物,TlXyn11B和突变体S3F、S3F/D35V和S3F/D35I的主要水解产物都是木二糖、木三糖和木四糖,说明该酶适合于生产益生元木寡糖。TlXyn10A和Xyl1OE热稳定性优良,但催化性能较差。本研究选择热稳定性优良、催化效率高的Xyl1OC作为模板,置换TlXyn1OA催化口袋中的非保守氨基酸,并设计突变体 TlXyn1 0A_P、TlXyn10A_N 和 TlXyn1OA_C。与原酶相比,TlXyn10A_P的Km值和Vmax都有所提高,从而提高了比活力,但催化效率几乎不变。分子动力学模拟分析表明TlXyn10A_P loop 4上的G149D可与底物形成氢键,而F232E和E229I减少了对底物的亲和力。为进一步研究loop4对木聚糖酶催化效率的影响,将Xyl10E中对应于TlXyn10A的148和149位氨基酸的160和161位点突变成Asp或者Glu,并测定突变体的催化效率。A160位突变成Asp或者Glu能够使酶Km值下降,而A161突变成Asp或者Glu能够使酶Vmax值提高。分子动力学模拟分析表明Glu160通过和Tyr204形成氢键提高底物亲和力,而Asp161则是通过和产物形成氢键可协助底物结合或加速产物释放。TlXyn10A和Xyl10E催化性能的提高证明了 loop 4可影响GH10木聚糖酶的催化。本研究丰富了工业可利用的木聚糖酶基因资源,同时也探索了热稳定性或催化性能提高的分子机制,在酶的基础理论研究和改良优化方面具有重要的意义。