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1.研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),亦称为老年性痴呆,是老年痴呆的最主要类别。其起病隐袭,以老年人(包括老年前期群体)为目标侵袭人群,是一种严重危害中枢神经系统的退行性疾病,其典型症状在于认知和记忆能力的持续损伤、自理能力下降和不适社交的人格变化。根据流行病学统计,AD在全部老年痴呆病人中可占据50%-70%,比例之大显而易见。而由于我国人口基数庞大,老龄化程度加快,且由于AD高致残率、高医疗费用支出的特点,造成极为棘手的社会负担,因此,对阿尔茨海默病的研究具有紧迫的现实意义。AD的经典病理生理改变为由β淀粉样蛋白肽段异常水解产生的β淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积形成的的老年斑、tau蛋白过度磷酸化聚集缠结的神经原纤维缠结(NFTs)。此外还有神经元大量凋亡,突触消失、线粒体障碍等病理改变。上述的病理改变也逐渐形成了各种尝试解释AD发生机制的各种假说,而事实上现在诸多机制假说均未能拿出令人信服的解释。大量研究表明,由小胶质细胞介导的过度的神经炎症反应在AD的病理发展过程中起着推涛作浪的重要作用。因此小胶质细胞的过度聚集和活化,受到越来越多的AD研究者关注。大量研究证实,低耐受性的音乐电针对于AD的干预具有卓尔不凡的优势。本研究以小胶质细胞活化为窗口,选取与AD反应密切相关的HMGB1和IL-10两个研究靶点,探究抑制过度神经炎症反应对AD模型的干预机制,探索更有效的治疗途径。2.研究目的本研究采用音乐电针和脉冲电针干预APP/PS1小鼠,以7月龄雄鼠为研究模型。通过实验干预和多种检测分析方法探究两种电针干预APP/PS1模型小鼠空间学习记忆能力及海马内HMGB1与IL-10表达的影响。探究音乐电针和脉冲电针两种电针法在“通督启神”指导下干预小胶质细胞两种极化状态下释放的蛋白因子对小鼠脑内炎性反应和空间记忆的差异背后的机制,进一步丰富行之有效的“通督启神”针法的学术思想。3.研究方法木研究选用动物实验,采用音乐电针和脉冲电针干预APP/PS1小鼠,以7月龄雄鼠为研究模型。将40只SPF级APP/PS1双转基因雄性小鼠,依照随机数字表法随机分为模型组、药物组和脉冲1电针组、音乐电针组,相同遗传背景和月龄的健康C57BL/6小鼠(雄性)作为正常对照组,以上各组均每组10只。在保证相同饲养环境和饮食前提下进行实验。首先用自制鼠套将脉冲电针组小鼠束缚并用夹子进行固定,参照标准实验动物使用的针灸穴位图谱选取百会、人中、印堂三个干预腧穴。首先用30号13mm毫针均向前平刺小鼠百会、印堂穴(避免两针体接触引起电针短路),进针长度约5mm,针柄连接启动电针仪,波型设置为疏密波,以小鼠头部皮毛稍稍抖动、不暴躁挣扎为宜,每次干预时间20min,起针后点刺小鼠人中,同样方法日行一次,连续干预15天。同样方法对音乐电针组小鼠处置,选取痴呆处方以节奏轻快为度。药物组按照0.92mg/kg盐酸多奈哌齐剂量1/Day给药。干预正常对照组、药物组和模型组小鼠时分别以自制鼠套抓取束缚20min,连续15天。4.研究结果4.1 Morris水迷宫测试结果4.1.1隐蔽平台实验结果各组实验小鼠随训练和检测时间推移,表现出逃避潜伏时间不同水平的下降趋势。正常对照组比较于模型组小鼠,航行时间很快显著下降,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。而药物组、脉冲电针组、音乐电针组第1天均与模型组在逃避潜伏时间结果上不具有统计学差异(P>0.05),从第2天开始,脉冲电针组、音乐电针组均与模型组逃避潜伏时间出现统计学差异(P<0.05),而第3天训练后,药物组、脉冲电针组、音乐电针组均与模型组出现统计学差异(P<0.05),并且音乐电针组与药物组相比也出现统计学差异,第4天与第5天训练后,药物组、脉冲电针组、音乐电针组均与模型组逃避潜伏时间有统计学差异(P<0.05),并且脉冲电针组、音乐电针组逃避潜伏时间明显低于药物组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常组的逃避潜伏时间相对最短,并且下降最快。其次是音乐电针组、脉冲电针组、药物组,模型组的逃避潜伏时间最长。音乐电针组逃避潜伏时间短于脉冲电针组,但无统计学意义(P>0.05)。4.1.2空间探索实验结果正常对照组的小鼠在目标象限探索的时间与总航行的时间比率最高,然后分别是音乐电针组、脉冲电针组、药物组和模型组,比率显著最低的是模型组,各组小鼠与模型组在目标象限探索的时间与总航行的时间比率均有明显统计学的差异(P<0.05),音乐电针组大于药物组,差异具有统计学意义(P<0.05)。音乐电针组在目标象限游泳时间与总时间之比大于脉冲电针组,但无统计学意义(P>0.05)。4.2免疫组化检测结果正常对照组海马中的HMGB1阳性数量表达最少,而模型组相同位置HMGB1表达最多,HMGB1阳性表达主要在胞浆和胞外。与正常组相比较,模型组HMGB1表达显著增多,具有统计学差异(P<0.05)。与模型组相比较,HMGB1明显在脉冲电针组和音乐电针组释放较少,具有统计学差异(P<0.05)。音乐电针组HMGB1表达少于脉冲电针组,但无统计学意义(P>0.05)。正常对照组海马IL-10阳性数量表达最多,模型组IL-10阳性数量分泌最少,IL-10主要阳性表达在胞质,胞核少量着色,整体表达呈棕褐色。与正常对照组比较,模型组IL-10阳性数量释放明显较少,有突出统计学差异(P<0.05)。与模型组小鼠海马相比较,明显脉冲电针组和音乐电针组IL-10阳性释放较多,具有统计学差异(P<0.05)。音乐电针组IL-10释放多于脉冲电针组,但无统计学意义(P>0.05)。4.3 Western Blot法检测结果与正常对照组小鼠海马HMGB1条带比较,模型组条带明显增粗,表示在模型组中蛋白HMGB1表达显著增加,具有统计学差异(P<0.05);与模型组小鼠海马HMGB1灰度值相比,脉冲电针组和音乐电针组的HMGB1蛋白表达显著较少,具有统计学差异(P<0.05);音乐电针组比脉冲电针组HMGB1灰度条带略细,HMGB1表达含量略少(P>0.05),两者没有统计学意义。与正常对照组小鼠海马IL-10条带比较,模型组蛋白表达显著较少(P<0.05);与模型组IL-10蛋白灰度条带相比,脉冲电针组和音乐电针组的IL-10释放显著较多(P<0.05);尽管音乐电针组比脉冲电针组灰度条带略粗,表示IL-10蛋白表达较多,但两者没有统计学意义(P>0.05)。5研究结论(1)行为学结果表明,“通督启神”法音乐电针与传统脉冲电针均可以改善阿尔茨海默病症状,音乐电针干预手段在修复小鼠的空间记忆和学习能力方面较传统脉冲电针组更有优势。(2)音乐电针对于抑制小胶质细胞M1型极化炎性因子HMGB1、促进小胶质细胞M2极化因子IL-10的表达的作用优于传统脉冲电针,对维持小胶质细胞两种极化状态平衡,改善AD动物模型症状有更好效果。(3)APP/PS1雄性小鼠作为成熟稳定的阿尔茨海默病动物模型,Aβ蛋白沉积明显,与之关系密切的小胶质细胞炎性活动活跃,是研究神经炎症与AD关系的理想模型。