琼胶酶能够降解琼胶多糖形成聚合度为2～10的琼胶寡糖,琼胶寡糖具有多种生物活性。本文对重组琼胶酶MS-GH42进行了分离纯化和理化性质研究,并对该琼胶酶降解产物进行了分离纯化、鉴定及活性研究。具体研究结果如下:1、利用硫酸铵盐析、透析、DEAE-阴离子交换层析的分离手段来纯化粗酶液,得到的酶液经过凝胶色谱柱G3000PWXL液相分析和SDS-PAGE凝胶电泳结果确定得到单一色谱峰和单一蛋白条带,证明得到纯化琼胶酶,蛋白分子量为72 kDa。琼胶酶的纯化倍数为42.3倍,酶活回收率为31.4%,比活力为112.5 U/mg。2、将收集到的纯化琼胶酶进行酶学性质研究,发现该重组酶的最适反应pH为7.0,为中性琼胶酶;最适反应温度为40℃;在pH 7.0～9.0之间稳定性较好,40℃条件下保温lh后,酶活力维持在85%以上,有较好的温度稳定性。3、通过计算活化能(Ea)、焓变(AH≠)、自由能(ΔG≠)和熵变(ΔS≠),发现该反应是个混乱度大的非自发吸热反应,Ea等于213.79 KJ/mol。利用双倒数法求得该琼胶酶的Km为2.1811 mg/mL,Vmax为3.635 U/(ml.min),kcat为5.483 s-1,说明该琼胶酶对底物有较好的亲和力。研究金属离子对酶活影响,浓度为10 mmol/L和1mmol/L的Fe3+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+对重组琼胶酶都有强烈的抑制作用,Na+、K+浓度在10 mmol/L情况下对酶活力的促进作用明显大于1 mmol/L。研究NaCl浓度对酶活力影响,在NaCl浓度为0～1.5 mol/L时,促进酶化反应,且有较好的盐耐受性。4、琼胶酶降解产物经过TLC、HPLC、质谱、核磁分析,确定存在新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖,随着酶解时间的增长,新琼二糖和新琼四糖的含量慢慢变多,终产物为新琼二糖和新琼四糖;大量酶解琼脂底物,浓缩得到25 mg/mL琼胶寡糖混合物,经过Sephadex LH-20凝胶柱分离,收集得到两个明显分离峰,经分析为高纯度的新琼二糖和新琼四糖。5、将四个不同组分的琼胶寡糖用于抗氧活性研究,以Vc作为对照试验,发现不同组分的琼胶寡糖都存在一定的抗氧化活性,但效率都不如Vc。羟自由基清除实验中,清除率最好的为六糖及以上组分,清除率为48.12%;在ABTS自由基清除实验中新琼二糖清除率最高,为76.21%(琼胶寡糖浓度10mg/mL);在琼胶寡糖浓度10mg/mL时,DPPH自由基清除率最高为新琼二糖29.14%;还原力实验中,在10 mg/mL的浓度下,新琼四糖还原力为0.366,是同浓度酶解混合物还原力的2.17倍。