研究背景肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康,其中大部分为非小细胞肺癌,约占80%。早期手术治疗是首选的治疗方法,但是由于多数病人在早期不易诊断,就诊时已是中晚期以及术后存在高的复发率,化疗仍是主要的治疗方法。以铂类药物为基础的联合化疗是非小细胞肺癌目前一线化疗方案,然而由于铂类药物的毒副作用和肺癌耐药的出现,限制了铂类药物的广泛应用。因此,寻找有效的方法和药物逆转肺癌耐药具有十分重要的意义。研究表明,顺铂的耐药性是由多因素,多因子参与的,存在多种机制,包括药物的蓄积降低、巯基分子如谷胱甘肽(GSH)的过度流入及其钝化作用、DNA修复能力增强以及细胞凋亡的抑制等。肺癌对顺铂的化疗敏感性改变可能与细胞周期管理基因、凋亡相关基因的表达改变有关。表观遗传修饰的分子机制主要包括DNA甲基化及组蛋白乙酰化,它们在基因表达调控起着重要的作用。表观遗传修饰的改变与肿瘤的发生发展密切相关,越来越多的证据表明,它们在肿瘤耐药中起着重要的作用。组蛋白去乙酰化酶抑制剂能抑制组蛋白乙酰化酶的活性,促进基因转录能诱导肿瘤细胞生长抑制、分化、凋亡,具有较广泛的应用前景。曲古抑素A(Trichostatin A,曲古抑素A)是组蛋白去乙酰化酶抑制剂的经典化合物之一,最初是作为一种抗真菌药物,能抑制Ⅰ、Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶,研究发现曲古抑素A诱导多种肿瘤细胞分化促进肿瘤细胞凋亡,并且对正常细胞毒性较低,因而被认为是一种有希望的新的抗癌药物。新近研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂能增强化疗或放疗的敏感性,具体机制仍待进一步研究。本实验拟以体外培养人肺腺癌A549细胞及其耐顺铂细胞株A549/CDDP细胞为研究对象,探讨曲古抑素A能否促进A549/CDDP细胞凋亡及提高其对顺铂的敏感性,并对其作用机制进一步研究,为临床肺癌的治疗寻找新途径和提供实验基础。目的研究曲古抑素A能否诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株凋亡并增强对顺铂的敏感性。方法1.常规培养A549、A549/CDDP细胞株,用中性红方法检测耐药指数。2曲古抑素A处理A549/CDDP细胞株3.荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期及线粒体膜电位的变化。4.曲古抑素A联合顺铂处理A549/CDDP细胞株。结果1.A549/CDDP细胞耐药指数为12.8。2.TSA对A549/CDDP细胞的IC50是446.59±27.32 nmol/L,随着曲古抑素A浓度升高,A549/CDDP细胞生长率明显下降。3.曲古抑素A处理A549/CDDP细胞株后,荧光染色主要表现为核染色质固缩,荧光染色增强。流式细胞仪检测亚二倍峰出现。流式细胞仪检测发现曲古抑素A阻滞细胞于S期,线粒体膜电位降低。4.低浓度(31.25、62.5 nmol/L)的曲古抑素A联合顺铂处理后,逆转倍数分别为1.52,1.70。结论1.人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP耐药性良好,耐药指数为12.8。2.曲古抑素A能诱导A549/CDDP细胞株凋亡。3.曲古抑素A阻滞A549/CDDP细胞株细胞周期于S期。4.曲古抑素A增加A549/CDDP细胞株对顺铂的敏感性。目的探讨曲古抑素A是否通过上调死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase,DAPK)表达增强人肺腺癌耐顺铂细胞株对顺铂敏感性。方法为了明确死亡相关蛋白激酶在曲古抑素A增加A549/CDDP细胞对顺铂敏感性的作用,将pcDNA3.1(+)-DAPK转染入A549/CDDP细胞,使其表达较高的DAPK水平。将对DAPK有负调控作用的DAPK-C末端导入A549/CDDP细胞,并应用RNA干扰技术抑制DAPK的表达,用曲古抑素A及顺铂进行处理,采用Western blot检测蛋白表达,中性红方法检测细胞抑制率。结果死亡相关蛋白激酶蛋白水平在A549/CDDP比在A549细胞中表达教低。当死亡相关蛋白激酶过表达时,A549/CDDP细胞对顺铂敏感性增加,曲古抑素A的作用增强。当死亡相关蛋白激酶活性被DAPK-C末端抑制及RNA干扰下调死亡相关蛋白激酶表达水平时,曲古抑素A的作用减低。结论死亡相关蛋白激酶的表达可能参与顺铂耐药,它的表达上调可能是曲古抑素A提高人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP对顺铂敏感性机制之一目的探讨曲古抑素A诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株凋亡的作用及机制。方法Western blot分析蛋白表达的变化,比色法测定Capase-8活性。结果Western blot结果显示,曲古抑素A处理细胞后,cFLIP蛋白水平下降,procaspase-8减少,提示Caspase-8被激活,促使Bid蛋白切割，使全长Bid蛋白水平减少，截断Bid条带增加。procaspase-3减少,提示此Caspase-3被激活。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白减少,PARP切割的条带逐渐增加,提示PARP活性增加,加促切割DNA,促进细胞凋亡。Western blot结果显示,曲古抑素A处理细胞后,cFLIP蛋白水平下降,同时观察到Caspase-8, Caspase-3, PARP被激活,Bid切割增加,曲古抑素A对Caspase-8活性和cFLIP的影响具有浓度和时间依赖性。结论曲古抑素A可以通过降低cFLIP水平激活Caspase-8诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP凋亡。目的探讨曲古抑素A诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株凋亡的作用机制。方法Western blot分析凋亡相关蛋白的变化。转染Bcl-2表达质粒过表达Bcl-2和利用siRNA下调Bcl-2表达水平。结果Westernblot结果显示,曲古抑素A处理细胞后,Bcl-2蛋白水平下降,而Bax表达上调,同时观察到Caspase-3被激活。转染Bcl-2表达质粒可以抑制曲古抑素A诱导的细胞凋亡,而沉默Bcl-2表达可以增加细胞对曲古抑素A的敏感性。结论曲古抑素A可能通过线粒体途径诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP凋亡。