论文部分内容阅读
近来发现VEGF-C、VEGFR-3与淋巴管生长及调控有关，研究肿瘤细胞内源性淋巴管新生因子可否诱导淋巴管发生，新生的淋巴管在癌细胞淋巴转移中的作用，分子调控敲出导致淋巴管新生因子的基因表达可否成为控制淋巴管转移的治疗方法等，对改变胃癌的治疗方案具有深远意义。
本文研究了VEGF-C/VEGFR-3细胞内信号传导、调控淋巴管新生因子对胃癌淋巴管侵袭及淋巴结转移转移的影响，对胃癌淋巴结转移的分子机制提供新的认识，为分子治疗胃癌淋巴结转移提供新的思路和理论，开拓新的治疗方法。
目的：研究VEGF-C和VEGFR-3在胃癌组织中的表达与淋巴结转移的关系，对胃癌患者预后的影响。siRNA干扰胃癌细胞内源性VEGF-C的基因和蛋白表达；含有shRNA质粒体内阻断胃癌实体肿瘤组织中VEGF-C基因及蛋白表达，进行siRNA治疗胃癌有效性的体内外实验研究。
方法：1994年4月-2003年12月手术切除的胃癌组织标本，根据胃癌数据库登记以及随访的结果，按照是否有淋巴结转移分为2组，每组性别、年龄、肿瘤部位、大体类型、病理组织学分类、浸润深度、浆膜侵袭、根治程度、腹膜播散、远隔脏器转移等无统计学意义差异，用VEGF-C、VEGFR-3、CD34单克隆抗体用DAB法免疫组化染色，用Kaplan-meier法，Logistc和CoxRegression分析对胃癌患者预后的影响。体外培养胃癌细胞株SGC7901，用nest-PCR进行VEGF-C基因的扩增，进行连接和转化，制备感受态细胞，进行重组质粒的鉴定、扩增，鉴定、克隆和测序VEGF-C基因的表达和序列。NCBIGenebank中VEGF-C基因(genebankNo.BC035212)与所克隆基因进行序列同源性比较，选择Ganbank的VEGF-C的AccessionNoBC035212用Sfold软件设计siRNA引物，设计了5条针对VEGF-C基因的不同部位的siRNA，并进行同源性检索，通过化学方法合成。pcDNA3.1/His/lacZ(β-半乳糖醛酸酶)质粒为报告基因，用肝癌细胞株HepG2成功建立siRNA建立转染系统。分别用Lipofectamin2000；TOPfect转染试剂介导pcDNA3.1/His/lacZ质粒，siRNA、pcDNA3.1/His/lacZ质粒转染SGC7901细胞，用干扰效果最好的引物，分别观察siRNA浓度分别为0.2μg；40μg；60μg和转染以后24小时、48小时、72小时转染率的变化，用荧光定量PCR和westernblotting检测VEGF-C的mRNA和蛋白表达变化。Westernblotting的VEGF-C抗体根据GenBank：NM005429.ReportsHomosapiensvasc...[gi：19924300]TheoreticalpI：7.77/Mw(averagemass)：46883.37/Mw(monoisoTOPicmass)：46851.90]为第一抗体。pshRNA-VEGF-C重组质粒干扰胃癌组织VEGF-C表达的体内实验研究，首先设计候选的siRNA序列和shRNA表达载体，将设计的核苷酸序列全合成，psilencer2.0-U6质粒用HindⅢ和ECoRⅠ酶切，鉴定。酶切产物电泳，进行胶纯化。VEGF-C-shRNA片段和psilencer载体连接、转化以及克隆鉴定，组成pshRNA-VEGF-C重组质粒。大量扩增质粒，进行提取，进行定量或纯度检测。核酸浓度大于90％，用取适量的pshRNA-VEGF-C重组质粒与TOPvivo混合，制备的pshRNA-VEGF-C重组质粒-TOPvivo复合物用于体内导入。实验动物为BALB/c-nu/numice裸小鼠，4-5周龄，体重15士2g，雌雄兼有。在无特定病原体((SPF)级环境中饲养。随机分为4组①对照组(n=12)②5-FU治疗组(n=12)③空质粒组(n=12)④ShRNA质粒治疗组(n=12)。胃癌细胞株SGC7901裸鼠皮下移植模型制作成功6周以后，取皮下胃癌组织块，建立胃癌原位移植模型，将切割成为1mm3大小，2块进行胃原位移植。原位瘤接种3周以后开始经裸鼠尾静脉高压注射给药，以0.1cm/kg液体量，经尾静脉穿刺，5秒钟内注入。间隔1次/5day，连续给药10次。5-FU剂量：30mg/kg，TOPvivo包裹空质粒，pshRNA-VEGF-C重组质粒剂量分别为50μg，对照组注射生理盐水，以0.1cm/kg剂量注射。观察指标：自然死亡率，成瘤率，淋巴结转移率，转移度，病理组织学检查，H-E染色，RTQ-PCR和Westernblotting观察VEGF-C和VEGFR-3基因和蛋白蛋白表达的变化。
结论：胃癌组织中VEGF-C在细胞质表达与胃癌淋巴管密度，淋巴结转移有关，是影响胃癌患者预后的重要因素之一。体外实验证明用siRNA技术可以有效地阻断胃癌细胞中内源性VEGF-C的基因及蛋白表达。pshRNA-VEGF-C重组质粒可以一定程度上抑制体内胃癌组织中VEGF-C的基因和蛋白质表达，影响发生淋巴结转移，shRNA干扰技术治疗体内实体肿瘤具有一定可行性。