罗非鱼是热带、亚热带地区的淡水和咸淡水水域的优良养殖鱼类品种,也是我国南方地区重点推广的优良养殖品种之一。然而,2009年以来,以无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)为主的罗非鱼链球菌病的连年暴发,已严重制约着我国罗非鱼的健康养殖。近年来嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等病原菌均可造成罗非鱼细菌性病害,增加了罗非鱼细菌性疾病的防控难度。当前,罗非鱼链球菌病的防控主要依赖抗生素等药物,但是抗生素滥用和长期使用易造成病原菌的耐药性和水产品的药物残留等问题。因此,生态防治显得尤为重要,寻求高效无公害的抗生素替代物具有重要的现实意义。本研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肠道中筛选出1株对淡水鱼类常见病原菌具有较强拮抗作用的细菌,并对其进行菌种鉴定、生物学特性研究。同时,研究其在饲料中添加投喂时对罗非鱼生长、肠道菌群组成、免疫机能和抗病力的影响,以期丰富罗非鱼链球菌病的生防微生物资源,也为拮抗益生菌在罗非鱼配合饲料中的应用提供理论依据。本研究取得的主要成果如下:1.罗非鱼源肠道拮抗芽孢杆菌的筛选及其生物学特性本研究从健康尼罗罗非鱼肠道中筛选1株(LF01)对罗非鱼源无乳链球菌等病原菌具有拮抗功能的益生菌,通过形态学、生理生化特征以及分子生物学分析,对LF01菌株进行鉴定。然后对LF01菌株的生长特性、水解淀粉和酪蛋白能力、药物敏感特性、抗菌谱和生物安全性进行测定和分析。结果表明菌株LF01为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。LF01菌株的最适生长温度为30 ~oC,最适pH值为7,最适盐度为5‰,而且该菌株具有水解淀粉和酪蛋白的功能。药敏实验结果显示,LF01菌株对多数抗生素敏感,仅对杆菌肽耐药。拮抗实验结果显示LF01株对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)、简氏气单胞菌(Aeromonas jandaei)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等病原菌均具有拮抗作用,其中对鰤鱼诺卡氏菌的拮抗作用最强,平均抑菌圈直径达28.3 mm。生物安全实验结果表明,LF01菌株对尼罗罗非鱼斑马鱼(Danio rerio)和乌鳢(Channa argus)等3种鱼均无致病性,表明该菌具有良好的生物安全性。本研究表明贝莱斯芽孢杆菌LF01生物安全性良好,而且可拮抗多种常见的水产病原菌,具有防控多种水产经济动物疾病的潜力,应用前景十分广阔。2.贝莱斯芽孢杆菌LF01抑菌物质的分离与特性分析为了探究贝莱斯芽孢杆菌LF01分泌抑菌物质的特性,本研究在最佳抑菌条件下经浓盐酸沉淀法获得拮抗物质,并对其拮抗性能进行检测,同时对其分泌的抗菌物质的稳定性进行研究。结果表明LF01菌株产生的拮抗物质存在于发酵液中,属于分泌型抗菌物质,并且能在酸性条件下沉淀析出,这表明抗菌物质的产生是该菌具有生防作用的原因之一。拮抗物质在-20 ~oC和-80 ~oC时保持较高活性,经121~oC高压灭菌后仍保持活性;在pH 4至10时,其抑菌活性保持相对稳定,在pH 2或pH 12仍保有活性;经蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,抑菌活性无显著变化,表明该活性物质对温度、酸碱度均具有良好的耐受性,而且对蛋白酶不敏感,由此确定该活性物质为非蛋白类物质。同时Time-kill实验表明,粗提液中无乳链球菌的数量在短时间内显著下降,甚至消失,表现出较强的抑菌甚至杀菌的作用。本实验表明该菌株具有作为水产拮抗益生菌应用的潜力,同时为深入研究拮抗益生菌LF01在罗非鱼配合饲料中的应用奠定基础。3.贝莱斯芽孢杆菌LF01对罗非鱼肠道菌群的影响及其免疫特性分析本研究通过基础饲喂实验和分子生物学分析法评估了贝莱斯芽孢杆菌LF01在尼罗罗非鱼幼鱼中的应用潜力。将贝莱斯芽孢杆菌LF01添加到基础饲料中,配制成终浓度为1.0×10~9 CFU/g的实验饲料。实验共设置对照组、间隔投喂组、连续投喂组三个处理,以投喂基础饲料组为对照组,间隔周期为3周,实验共持续9周。通过饲喂实验,评价添加拮抗菌LF01对尼罗罗非鱼幼鱼生长、免疫应答、肠道微生物菌群及对无乳链球菌感染抗病力的影响。结果表明,实验结束时,连续投喂组中各生长指标显著高于对照组,但与间隔投喂组差异不显著,在投喂期间各组存活率无显著差异,由此说明,将该拮抗菌以拌料投喂方式应用时,可以显著提高罗非鱼的生长;间隔投喂组和连续投喂组中血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活性显著高于对照组,而血清中碱性磷酸酶活性、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量无显著变化;罗非鱼经拮抗菌LF01拌料投喂后显著提高其对无乳链球菌的抗病力,在连续投喂9周时相对免疫保护率达到最高70.59%。同时,投喂拮抗菌LF01后,免疫相关基因lyzc、C3和MHC-Ⅱβ在罗非鱼肠、鳃和头肾组织中的相对表达量总体均上调表达,这表明饲喂LF01菌株后能够激发罗非鱼的体液免疫反应,增强鱼体的免疫力。此外,肠道微生物菌群结构分析结果显示,无论饲料中是否添加拮抗菌LF01,Fusobacteria、Proteobacteria和Planctomycetes在罗非鱼肠道中均占主导地位,但不同时期细菌丰度差异明显。连续投喂组罗非鱼肠道中的爱德华氏菌(0.22%)和邻单胞菌(0.70%)的比例均显著低于对照组(分别为2.33%和2.69%),间隔投喂组罗非鱼肠道中的爱德华氏菌(0.01%)也显著低于对照组(2.33%)。这表明投喂LF01菌株可显著降低罗非鱼肠道中某些病原菌的数量。综上可知,贝莱斯芽孢杆菌LF01对于罗非鱼健康养殖具有积极的促进作用,有望作为益生菌制剂应用于水产养殖中,具有广阔的应用前景。