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[研究背景]胰腺癌是一种发病率较低但预后极差的肿瘤,是大多数发达国家癌症死亡的第四大常见原因。胰腺癌每年导致43.2万人死亡,患者的5年相对生存率仅为9%。约80～85%的病人首次诊断时已经发生了局部侵袭和远处转移。研究表明,肿瘤微环境在胰腺癌生物学特征的形成中具有重要作用,消除癌细胞的同时靶向支持其发展的肿瘤微环境可能是未来胰腺癌治疗的有效方案。胰腺星状细胞(PSC)在胰腺癌微环境中具有核心作用,其活化能促进胰腺癌的侵袭、转移和耐药。其激活的核心事件是上皮-间充质转化(EMT)。TGFβ/Smad通路是导致胰腺癌发生EMT的重要通路。miR-21是与TGFβ1和EMT相关特征最明确的miRNA。中医药治疗胰腺癌具有独特优势,多种中药抗肿瘤的作用与EMT和miRNA的表达变化密切相关。导师的前期研究显示,运用靶动脉灌注化疗联合华蟾素注射液泵入治疗晚期胰头癌,能够抑制肿瘤生长,缓解癌痛,延长患者生存期,局部疗效较好,但具体机制尚不清楚。为此,本实验用TGFβ1刺激制备胰腺星状细胞体外活化模型,并通过转染使其高表达miR-21,以增强胰腺星状细胞的恶性表型;以华蟾素注射液为干预药物,测定各组中miR-21、TGFβ/Smad通路相关分子、EMT相关分子的基因和蛋白表达水平,分析结果,探讨华蟾素通过miR-21调控活化胰腺星状细胞的EMT表型来影响胰腺癌微环境的具体作用。[研究目的]明确华蟾素是否可通过miR-21调控TGBβ/Smad信号通路,干预活化胰腺星状细胞的EMT进程,从而影响胰腺癌微环境。进一步阐明华蟾素治疗胰腺癌的机制,以及在胰腺癌治疗中对肿瘤微环境的影响。[研究方法]运用细胞实验的方法,培养人胰腺星状细胞(PSC),经不同浓度华蟾素注射液、吉西他滨及两种药物联合处理48h后,用CCK-8法检测其对PSC的抑制率。用TGFβ1刺激制备PSC活化模型,在活细胞动态成像系统内观察细胞形态;以华蟾素为药物进行干预,分别命名为TGFβ1组、华蟾素+TGFβ1组、华蟾素组、miR-21高表达组、miR-21抑制剂组、miR-21空转对照组和空白对照组。用Lipo 2000试剂转染miR-21 mimics为miR-21高表达组;转染miR-21 inhibitor为miR-21抑制剂组;转染mimics NC作为空转阴性对照组。用实时荧光测定(qRT-PCR)法、免疫印迹杂交(westernblot)法测定各组中miR-21、TGFβ/Smad通路相关分子、EMT相关分子的基因和蛋白表达水平。分析结果探讨华蟾素通过miR-21调控胰腺星状细胞的EMT表型来影响胰腺癌微环境的具体机制。[研究结果](1)用CCK-8法检测各组药物处理48h后对PSC的抑制率。华蟾素对PSC的半数抑制浓度(IC50)值为28.405 mg/ml;吉西他滨对PSC的IC50值为1.24μg/ml。华蟾素联合吉西他滨对PSC的IC50值为:华蟾素4.71 mg/ml+吉西他滨1 μg/ml。华蟾素联合吉西他滨对PSC的抑制作用呈浓度依赖性,华蟾素浓度越高,抑制越明显;(2)用TGFβ1处理48小时后,PSC的形态较加药前发生明显改变。未经TGFβ1刺激的静态PSC,细胞体积较小,表现为典型的类圆形和多边形;经TGFβ1刺激后的PSC,细胞体积增大,表现为长纺锤形的成肌纤维细胞形态,提示PSC发生活化;(3)通过qRT-PCR法检测各组miR-21的相对表达量。在华蟾素浓度分别为15 mg/ml、30 mg/ml、60 mg/ml时,miR-21的相对表达量随药物浓度的升高而下降,在华蟾素浓度为60 mg/ml时,对miR-21的抑制最明显;(4)用TGF-β1刺激PSC发生活化后,其miR-21的表达升高;TGF-β1组加用华蟾素后,其PSC中miR-21的相对表达量较前降低。转染miR-21 mimic后的PSC,其miR-21的表达显著升高;而转染miR-21 inhibitor后,miR-21的表达受到明显抑制;(5)用qRT-PCR法和WB法检测各组EMT相关分子的基因和蛋白表达水平。经TGF-β1激活后的PSC,和经miR-21 mimic转染后的PSC,其上皮标记物E-cadherin的相对表达量下调,而间质标记物N-cadherin的相对表达量上升;使用miR-21 inhibitor后结果相反。联合使用华蟾素后,可升高活化PSC中E-cadherin并降低N-cadherin的表达,但其下调N-cadherin表达量的趋势不明显;(6)用qRT-PCR法和WB法检测TGF-β/Smad通路重要分子的基因和蛋白表达水平。经TGF-β1激活后的PSC,和经miR-21 mimic转染后的PSC,其通路下游Smad2和Smad3的基因和蛋白表达量明显升高;相反,用miR-21抑制剂处理PSC后,Smad2和Smad3的蛋白表达量降低。[研究结论](1)华蟾素可抑制活化胰腺星状细胞的增殖。使用吉西他滨时联合应用华蟾素可在相同抑制范围内减少吉西他滨用量,起到减毒增效的作用;(2)华蟾素能够下调被TGFβ1激活的PSC中miR-21的表达量,抑制TGFβ1诱导的PSC活化;(3)华蟾素能够通过下调miR-21,抑制活化胰腺星状细胞发生的上皮-间充质转化。(4)华蟾素可通过下调miR-21的表达抑制TGFβ/Smad通路的活性;总结:华蟾素可通过下调miR-21的表达抑制TGFβ/Smad通路活性,降低活化的胰腺星状细胞的增殖活性和形成EMT的能力,从而改善胰腺癌微环境。