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果胶质广泛存在于高等植物,是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分,作为高分子聚合物,骨架为α-1,4糖苷键连接的聚半乳糖醛酸,部分甲酯化,在富含聚L-鼠李糖区域有木聚糖和阿拉伯半乳聚糖侧链,结构复杂。果胶质的存在使得人们在对植物的加工利用中遇到一些困难,如降低了速溶茶的溶解性、增加了动物饲料的粘度进而阻碍动物对营养物质的摄取吸收、严重影响造纸过程中纸浆的过滤、妨碍苎麻及棉织物的纺织前处理中对纤维的精炼等。果胶裂解酶Pectate lyases(E.C.4.2.2.2),通过β-消除反应作用于聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic Acid)的α-1,4糖苷键,进而分解果胶质;近年来,随着“绿色纺织、清洁生产”的倡导,纺织前处理中利用酶精炼代替传统的碱精炼受到越来越多的重视,果胶裂解酶作为前处理工艺中最有效的酶制剂成为研究的热点。本研究从基因库中查找到分别来源于芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的两种果胶裂解酶基因pel-s(Gene Bank:AB428424)和pel-b(Gene Bank:GU206787)的序列,鉴于Pichia pastoris外源蛋白表达量高、具有强效的AOX1启动子、便于基因工程操作和高密度发酵等优点,利用其作为宿主菌,实现了果胶裂解酶在P.pastoris中的分泌表达;本课题的主要研究内容及结果如下:(1)对全基因合成的pel-s进行信号肽预测,并克隆至由本实验室构建并保存的p HKA载体上,利用来源于酿酒酵母的α-factor以及预测的自身信号肽PF对表达的异源蛋白进行引导分泌,并对AOX1启动子的推测转录因子结合位点进行微调,构建重组毕赤酵母菌株G/p HKA-α-pel-s、G/p HKA-PF-pel-s和G/p HKA-AOXm-PF-pel-s。相对于α-factor,自身预测信号肽PF的使用使得甲醇诱导144 h时酶活提高了111.66%,在此基础上对启动子进行改造使酶活进一步提高了51.47%,达到89.65 U/m L。在优化后的表达元件基础上,通过体外构建多拷贝串联表达盒的方法提高重组载体上pel-s的基因剂量,构建两拷贝和四拷贝重组酵母菌株,诱导144 h,两拷贝菌株酶活达到186.96 U/m L,比单拷贝提高了108.55%,而四拷贝重组菌酶活达到309.65 U/m L;将四拷贝进行50 L罐发酵,果胶裂解酶活力达到1729.35 U/m L,是摇瓶水平的5.58倍,发酵上清中蛋白量也达到了9.48 g/L。利用亲和层析对Pel-s进行纯化,Pel-s的最适温度和p H为80oC、10.0,室温(25 oC)条件下在p H3.0-11.0的不同缓冲液中处理16 h,剩余酶活力达到90%以上,而将Pel-s在30-50 oC下处理240 min,酶活力基本无变化,在60 oC处理180 min酶活力剩余约40.71%,在70 oC处理180 min剩余酶活力仅约16.81%。金属离子对两种酶催化活力的影响实验表明,两种酶的催化活性都依赖于Ca2+。(2)相同的方法构建分泌型重组毕赤酵母菌株G/p HKA-SP-pel-b、G/p HKA-α-pel-b及G/p HKA-AOXm-α-pel-b,对重组菌产酶情况进行分析,甲醇诱导168 h,α-factor分泌能力是SP的14.65倍,酶活力达到307.25 U/m L,启动子改造后发酵上清中酶活力达到了432.36 U/m L,提高了40.72%,高于目前已报道的摇瓶发酵的水平。重组酶Pel-b的最适温度和p H为60 oC、10.0,室温(25 oC)条件下在p H 9.0-11.0的不同缓冲液中处理16 h,剩余酶活力达到90%以上,在30-50°C水浴处理300 min时活力仍然剩余80%以上,在60 oC下处理240 min,酶活力剩余约40.75%,热稳定性良好,符合棉织物精炼对热稳定性和耐碱性的要求。