论文部分内容阅读
研究背景及目的:哮喘是一种常见的气道慢性非特异性炎症性疾病,近年来由于人们生活环境的改变,在全球范围内哮喘的发病率和病死率明显增加,在全世界已影响了近3亿人。气道上皮细胞是机体和环境之间的第一道防线,它的主要功能是作为物理屏障抵御外部环境中微生物,气体和过敏原等的侵袭。而气道上皮细胞的物理屏障功能是依赖于细胞的完整性和细胞间连接蛋白的相互作用。我们的课题组前期研究已证明屋尘螨可以破坏气道上皮屏障功能,而如何改善过敏原所致的气道上皮的损伤已经成为哮喘防治研究的关注重点。研究表明胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)在哮喘的预防和治疗中扮演重要的角色。新近研究发现TSLP有不同的两个亚型即长链TSLP(1fTSLP)及短链TSLP(sfTSLP),近年来有关sfTSLP和1fTSLP的不同作用已引起了关注,然而,sfTSLP和1fTSLP在哮喘中是否也发挥着不同的作用,现在尚未见到报道。针对上述问题,本课题拟在体内和体外实验探讨:1.1fTSLP是否促进了HDM诱导的气道上皮屏障破坏?2.合成的sfTSLP是否可以保护HDM诱导的气道上皮屏障破坏?3.进一步明确在HDM所导致的哮喘性气道上皮屏障破坏中,1fTSLP发挥破坏作用和sfTSLP发挥保护作用的可能机制。研究方法1.体外实验:1.1人正常支气管上皮细胞系(16HBE)的培养。1.2使用Western blot、RT-PCR、TER、FITC和免疫荧光检测不同时间点及不同浓度的HDM对16HBE细胞的影响。1.3 使用 RT-PCR、TER、FITC 和免疫荧光检测 1α,25-Dihydroxyvitamin D3(1,25D3)对细胞sfTSLP表达及HDM导致的气道上皮细胞屏障的破坏的影响。1.4使用Western blot检测HDM是否通过MAPK通路引起1fTSLP的增高。1.5使用Western blot、TER、FITC和免疫荧光检测1fTSLP对气道上皮细胞屏障的直接影响及STAT5信号通路在这个过程中的作用。1.6使用Western blot、TER、FITC和免疫荧光检测sfTSLP对HDM和1fTSLP诱导的气道上皮屏障的破坏的影响。2.体内实验:2.1BALB/c 小鼠 60 只,随机分为:(1)control(2)1,25D3(3)sfTSLP(4)HDM(5)1,25D3+HDM(6)sfTSLP+HDM。所有小鼠每周连续 5 天进行相应处理,进行8周。2.2小鼠完成最后一次操作24小时后进行动物无创肺功能检测小鼠气道反应性,收集血清使用ELISA检测IgE;收集小鼠的肺泡灌洗液检测IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33、TSLP(1fTSLP)。2.3取出小鼠左肺进行HE染色和E-cadherin、β-catenin和1fTSLP的免疫组织化学染色;取出小鼠右肺组织提取全肺蛋白,使用Western blot检测目的蛋白。3.应用SPSS 19.0分析数据。研究结果:1.在16HBE细胞中,HDM上调1fTSLP的表达和破坏气道上皮屏障。2.在16HBE细胞中,1,25D3上调sfTSLP的表达和抑制了 HDM所导致的气道上皮屏障的破坏。3.在16HBE细胞中,HDM通过激活MAPK信号通路导致1fTSLP的上调。4.在16HBE细胞中,1fTSLP通过激活STAT5信号通路破坏气道上皮屏障。5.在16HBE细胞中,sfTSLP可以保护HDM和1fTSLP导致的气道上皮屏障的破坏。6.在HDM导致的哮喘小鼠模型中,1,25D3和sfTSLP通过抑制ERK和p38信号通路来保护HDM所致的气道炎症和气道屏障蛋白的破坏。研究结论:1.HDM可通过ERK和p38信号通路的磷酸化促进1fTSLP的表达,而高表达的1fTSLP可通过激活STAT5信号通路来破坏16HBE细胞气道上皮屏障功能。2.在16HBE细胞中,1,25D3可上调sfTSLP的表达,而sfTSLP可以修复HDM和1fTSLP导致的气道上皮屏障的破坏。3.在HDM诱导的哮喘小鼠模型中,1,25D3和sfTSLP可通过抑制ERK和p38信号通路来改善HDM所致的气道炎症和气道屏障蛋白的破坏。