鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)作为多种宿主感染的病原菌,能够导致胃肠炎等疾病。它的致病性和许多毒力因子息息相关,比如三型分泌系统、毒力质粒、鞭毛、菌毛等。其中鞭毛作为细菌的主要毒力因子之一,不仅是细菌重要的运动器官,而且也参与了菌膜形成和上皮细胞的粘附等重要的生物学过程。另外鞭毛结构的主要成分-鞭毛蛋白也是一种重要的免疫激活剂,通过结合TLR5受体激活免疫应答,进而刺激一系列细胞因子的产生。鞭毛结构由鞭毛丝、鞭毛钩、基体(马达、至少四个环状结构和鞭毛三型分泌系统)三部分组成。其中鞭毛钩由FlgE蛋白构成,作用是连接鞭毛丝和基体。鞭毛三型分泌系统又称鞭毛输出系统,主要用于合成和输出鞭毛蛋白。鞭毛钩和鞭毛输出系统的存在对于鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛结构具有重要作用。为了深入了解鞭毛结构中相关基因的特性及相关分子机制,诠释细菌的致病机制,本文从以下3个方面开展了研究:(1)鞭毛钩蛋白由flgE基因编码,通过异源表达获得该蛋白并制备多克隆抗体。本实验通过克隆flgE基因并连接pET28a质粒,通过诱导表达得到的蛋白大小为42 kDa且具有可溶性。利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA和蛋白免疫印迹的结果分别表明该多克隆抗体具有良好的效价而且可以与鞭毛蛋白特异性地结合。(2)建立鞭毛蛋白与巨噬细胞作用模型,从不同层面分析鞭毛钩蛋白FlgE引起的免疫反应。通过CCK8细胞活力测定试剂盒检测细胞活力以及利用实时荧光定量PCR验证了细胞因子mRNA的相对表达水平,并利用荧光显微镜观察活性氧的产生情况。结果显示:低浓度的鞭毛蛋白不影响细胞活力且能够促进一系列细胞因子如IL-1α、TNF-α等的表达。同时,鞭毛蛋白也能促进巨噬细胞活性氧的产生。(3)构建鞭毛输出系统基因flhA、flhB缺失株及回补菌株,从不同层面分析细菌的表型变化。结果显示:相对于野生型来说,ΔflhA和ΔflhB的生长性能并未受影响,但是其运动能力有一定的下降。利用结晶紫染色法评估了细菌在不同时间的菌膜形成能力。结果清楚地表明了缺失了flhA或flhB基因后,菌膜形成能力减弱。同时,和菌膜形成相关的细菌自聚集能力也明显受到影响。综上,从蛋白水平、分子水平对鞭毛的两种结构系统的分析,加深了对鞭毛结构的认知,不仅有助于了解细菌的致病机制,同时也为抑制细菌感染等后续工作奠定了基础。