研究背景：基因功能异常分为两大类机制：遗传学机制和表遗传学机制。在遗传学机制中，许多DNA损伤修复基因通过多种修复途径参与了损伤的修复并保持基因组的稳定性，这些基因的改变可能导致疾病或肿瘤的发生。许多研究局限于每次只能对一个RNA样本进行实时定量PCR检测。Taqman低密度表达谱芯片新技术可根据研究需要订制、高灵敏度、高通量同时分析多个样本多个基因的表达。继人类基因组计划圆满完成之后，“人类基因组外遗传计划”正式启动。大部分情况下，人类疾病有半数原因与基因遗传有关，另一半则取决于基因组外遗传变化。基因组外遗传变化被认为是控制基因活动的“开关”。甲基化作为基因组外遗传机制的重要组成部分，是联系基因遗传、环境因素和疾病发生的重要纽带。发现并分析人类基因的甲基化状态，将有助于癌症诊治、甚至在基因变异之前即可预测是否有癌症发生的危险。目前，肿瘤的甲基化研究是国内外研究的热点，但在胶质瘤中的研究相对较少。研究目的：研究基因功能异常的两大类机制：遗传学机制和表遗传学机制中代表性的研究领域：1．在遗传学机制中，通过Taqman低密度表达谱信息分析，从DNA损伤修复基因中选择5个主要DNA损伤修复通路的27个代表性基因，探讨胶质瘤的基因表达特征与临床资料之间的内在联系与规律，高通量、系统的研究可为胶质瘤临床诊断、判断预后等提供更多、更准确的理论依据，为进一步研究其功能奠定了基础。2．在表遗传学机制中，研究肿瘤抑制基因在胶质瘤中的启动子区DNA甲基化和mRNA表达情况，并进一步分析甲基化发生与mRNA表达变化的内在因果联系及其与临床情况之间的关系。初步探讨去甲基化药物对肿瘤抑制基因甲基化和mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞凋亡的影响，为去甲基化药物临床用于胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。研究方法：1．临床收集88例原发胶质细胞瘤（WHO分级：Ⅱ级23例，Ⅲ级20例，Ⅳ级45例）和10例正常脑组织标本。所有病人术后均进行5年随访。2．网上在线设计内参基因GAPDH和27个DNA损伤修复基因：直接修复基因（MGMT），碱基切除修复基因（MPG、MUTYH、NTHL1、OGG1、SMUG1、UNG、XRCC1），核苷酸切除修复基因（ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、NUDT1），错配修复基因（MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS2）和双链断裂修复（MRE11A、MUS81、RAD50、RAD51、RAD52、XRCC3、XRCC4、XRCC5）五个损伤修复通路的基因引物和探针，定制微流卡（Micro Fluidic Card，MFC）。3．使用Taqman低密度表达谱芯片技术，于7900HT荧光定量PCR仪上对其中40例不同病理级别原发胶质瘤组织（Ⅱ级10例、Ⅲ级10例、Ⅳ级20例）和10例正常脑组织实时、定量PCR检测27个选定的DNA损伤修复基因以及内参基因mRNA表达情况，并用SDS2.2图像分析软件进行处理，通过△Ct法和2^-△△Ct法两种分析方法对最后的结果进行统计学分析。4．结合临床资料分析27个相关DNA损伤修复基因在其中40例不同病理级别原发胶质瘤组织和10例正常脑组织中的mRNA表达情况及各基因在不同性别组和不同年龄组中的表达差异。5．结合病人的术后生存时间，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较分析不同基因的mRNA表达水平与患者预后的关系。6．甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）方法，检测LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC等5个肿瘤抑制基因在88例胶质瘤组织、10例正常脑组织的DNA甲基化情况。7．传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和SYBGreen实时定量PCR（Real-time PCR）方法，检测5个基因在其中30例胶质瘤（Ⅱ级10例，Ⅲ10例，Ⅳ10例）和10例正常脑组织中的mRNA表达情况，分析5个基因DNA甲基化发生率与其mRNA表达水平之间及与临床资料之间的关系。8．甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC）处理两种胶质瘤细胞株U251和SHG-44 72h前后，RT-PCR和MSP检测5个基因的表达和甲基化状态的变化。通过PI染色，采用流式细胞技术（flow cytometry，FCM）检测5-Aza-dC作用U251和SHG-44细胞株不同时间后对细胞凋亡的影响。研究结果：1．2^-△△Ct分析方法结果表明，27个DNA损伤修复基因中与正常脑组织相比有13个DNA损伤修复基因在Ⅱ级，Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中均表达下调，包括ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLH1、MLH3、NTHL1、OGG1、RAD50、SMUG1、XRCC4、XRCC5（P＜0.01）。在13个DNA损伤修复基因中，MLH3基因在Ⅲ级胶质瘤中的表达低于Ⅱ级中的表达，并有显著差异（P＜0.01）；XRCC4基因在Ⅳ级胶质瘤中的表达低于Ⅱ级中的表达，并有显著差异（P＜0.01）。其余14个基因中，MSH2、MSH6、NUDT1和XRCC3基因只在Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤中下调（P＜0.01）；MRE11A和MUSS1基因只在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中表达下调（P＜0.01）；PMS2、RAD52和XRCC1基因只在Ⅲ级胶质瘤中表达下调（P＜0.01）；UNG基因只在Ⅱ级中表达下调（P＜0.01）。MPG、MSH3、MUTHY和RAD51在正常脑组织、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中的表达均无明显差异（P＞0.05）。2．27个DNA损伤修复基因在29例男性胶质瘤患者和11例女性胶质瘤患者中的表达无明显差异（P＞0.05）；其在＜40、40-60和＞60岁三个年龄组中的表达也均无明显差异（P＞0.05）。3．在27个DNA损伤修复基因中，ERCC3、ERCC4、MLH3、MRE11A、NTHL1、RAD50、XRCC4和XRCC5基因表达下调与预后有关（P＜0.05）。4．在88例胶质瘤中，LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC等5个基因启动子区甲基化发生率分别为63.66％、71.50％、86.36％、70.45％和57.95％：而在10例正常脑组织中均未检测到LATS1、LATS2、SLC5A8和TMS1／ASC等4个基因的甲基化发生，PCDH-γ-A11基因甲基化率亦仅为20％。5个基因的甲基化率在Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤中与正常脑组织比较均有显著差异（P＜0.05），在不同病理级别间部分存在统计学差异。其中SLC5A8基因在Ⅳ级和Ⅱ级胶质瘤中的DNA甲基化率比较有显著性差异（P＜0.05）。LATS1、LATS2和PCDH-γ-A11基因的甲基化率在两性别组间以及在不同年龄组间比较均无统计学差异（P＞0.05）；SLC5A8和TMS1／ASC基因在＜40与＞60岁、40-60岁与＞60岁年龄组间的甲基化率差异均有统计学意义（P＜0.05）。5．LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因在Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤中的mRNA表达与正常脑组织相比均明显下调（P＜0.05），在不同病理级别间部分存在统计学差异。其中，SLC5A8的mRNA表达在Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤中、TMS1／ASC的mRNA表达在Ⅱ级和Ⅲ级及Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤中的表达均有显著差异（P＜0.05）。LATS1、LATS2和PCDH-γ-A11基因的mRNA表达在两性别组间以及在不同年龄组间比较均无统计学差异（P＞0.05）；SLC5A8的mRNA表达在不同年龄组之间差异均有统计学意义（P＜0.05），但TMS1／ASC的mRNA表达只在年龄＜40岁和年龄＞60岁组及40岁＜年龄＜60岁和＞60岁组之间有统计学差异（P＜0.05）。6．LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因中各基因发生甲基化的胶质瘤样本中的mRNA的表达水平，明显低于该基因未发生甲基化的胶质瘤样本（P＜0.05）。7．U251和SHG-44细胞株中均检测到LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因的甲基化。5μM的5-Aza-dC处理72h可诱导5个基因部分去甲基化，重新激活并显著上调其mRNA的表达。5μM的5-Aza-dC作用于U251胶质瘤细胞株24h、48h和72h后的细胞凋亡率分别为8.99％、24.40％和46.75％，作用于SHG-44胶质瘤细胞株24h、48h和72h后的细胞凋亡率分别为13.85％、32.35％和62.50％，均大于同期DMSO对照组的细胞凋亡率。研究结论：1．ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLH1、MLH3、NTHL1、OGG1、RAD50、SMUG1、XRCC4、XRCC5等DNA损伤修复基因的表达下调，与胶质瘤的发生密切相关。Taqman低密度表达芯片为多个基因的同时定量表达提供了一种准确、快速、有效的多变量检测技术，可用于发现新的肿瘤相关基因。2．肿瘤抑制基因LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC在胶质瘤中的启动子区高甲基化率，导致其mRNA表达下调。肿瘤抑制基因的甲基化在胶质瘤恶性增殖和抗细胞凋亡过程中发挥重要作用。去甲基化药物有望为胶质瘤的化学治疗提供新的手段。