肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是各种慢性肝病向肝硬化乃至肝癌发展的必经途径和必然阶段,肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝脏中细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的主要来源,在各种刺激因素作用下,其激活并转化为肌成纤维样细胞,进而合成大量的胶原等ECM成分,是肝纤维化发生发展过程的中心环节。因此,如何抑制HSCs活化、增殖并促进其凋亡是逆转肝纤维化的关键所在。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,可抑制肿瘤细胞增殖,诱导其凋亡,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,对PTEN的研究在肿瘤领域已经取得了重大进展,且已逐渐延伸至非肿瘤领域。有研究发现PTEN蛋白表达异常或活性的改变在器官纤维化过程中发挥重要作用。而我们的前期研究表明,在胆总管结扎致肝纤维化大鼠肝组织中PTEN蛋白及mRNA的表达均低于其在正常大鼠肝组织中的表达,并与在体HSCs的活化、增殖呈显著负相关,且PTEN过表达可显著抑制体外活化HSCs的增殖并诱导其凋亡。但阻断PTEN表达对体外活化HSC增殖、凋亡的影响及相关信号转导机制仍不清楚。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,可以特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应的蛋白水平及功能。为此,我们在前期研究的基础上,以腺病毒为载体,构建了靶向PTEN的短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰重组体,应用转基因技术,在体外感染活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6,构建了HSCs的PTEN低表达模型,观察阻断PTEN表达对活化HSCs增殖、凋亡的影响,从反面探讨PTEN在调控HSCs生物学行为中的作用,以期从正反两面揭示PTEN调控HSCs增殖、凋亡的可能性及信号转导机制,从而为寻求治疗肝纤维化的有效新靶点提供实验数据和理论依据。目的:观察阻断PTEN表达对体外活化HSCs增殖与凋亡的影响及其信号转导机制。方法:利用AD293T细胞扩增实验所需要的重组腺病毒(Ad-EGFP、PTEN shRNA),并在荧光显微镜下检测病毒滴度,进一步感染体外活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6。实验分组如下:①Control组,以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在转染步骤加入无血清无抗生素的DMEM代替病毒液;②Ad-EGFP组,转染表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的空病毒Ad-EGFP;③PTEN shRNA组,转染靶向PTEN的RNA干扰序列并表达EGFP的重组腺病毒PTEN shRNA。采用直接细胞计数法绘制HSCs生长曲线,MTT法测定HSCs增殖;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法、流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测HSCs凋亡;采用Western blot技术检测PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1及p-ERK1、蛋白表达情况;real-time Q-PCR方法检测PTEN、Akt及ERK1 mRNA的表达情况。结果:①通过反复感染AD293T细胞使病毒扩增,从而获得了实验所需要的病毒液(Ad-EGFP、PTEN shRNA的滴度分别为1.2×109 pfu/mL、1.1×109 pfu/mL);②应用real-time Q-PCR检测腺病毒感染HSCs后72 h活化HSC的PTEN mRNA表达,并采用2-△△Ct相对定量法比较各组HSC中PTEN mRNA表达的差异,以Control组为对照组,则Ad-EGFP组、PTEN shRNA组较Control组的PTEN mRNA的相对倍数为0.93倍和0.63倍。其中PTEN shRNA组PTEN mRNA表达明显低于Control组及Ad-EGFP组(P<0.05);而Ad-EGFP组与Control组之间无显著性差异(P>0.05)。进一步应用Western blot法检测分析PTEN蛋白在各组细胞中的表达,PTEN shRNA组(1.11±0.03)显著低于Control组(1.49±0.04)及Ad-EGFP组(1.48±0.02), P<0.05;而Ad-EGFP组与Control组之间无显著性差异(P>0.05)。可以证明PTEN shRNA已成功转染体外活化的HSC;③细胞生长曲线结果显示:腺病毒转染24 h时,三组之间无明显差别,转染48 h、72 h后,与Control组相比,PTEN shRNA组可以促进HSCs生长,并随时间延长其增殖率逐渐升高,于72 h达最高,较Control组升高了22.5%;Ad-EGFP组的增殖率在各时间点与Control组无明显差别;④MTT检测结果显示:腺病毒感染活化HSCs后24 h,Ad-EGFP及PTEN shRNA对细胞增殖均无明显作用(P>0.05)。而在48 h、72 h时PTEN shRNA可刺激HSCs增殖,其增殖率分别为29.51%、43.29%(以Control组为对照)。在48 h、72 h时Ad-EGFP组与Control组A值比较无显著性差异(P>0.05);⑤TUNEL法检测结果显示,腺病毒感染HSCs后72 h,PTEN shRNA组HSCs凋亡率为2.94%±0.31%,低于Control组(5.17%±0.27%)及Ad-EGFP组(5.34%±0.43%),P<0.05;而Ad-EGFP组与Control组之间无显著性差异(P>0.05);⑥PI标记的流式细胞术的检测结果显示,PTEN shRNA组HSCs凋亡率(1.26%±0.18%)低于Control组(3.28%±0.42%)及Ad-EGFP组(2.95%±0.41%),P<0.05;Ad-EGFP组与Control组比较无显著性差异(P>0.05);⑦应用Western blot技术检测腺病毒感染HSCs后72 h时Bax蛋白在各组细胞中的表达,其结果显示:PTEN shRNA组(0.98±0.04)显著低于Control组(1.29±0.03)及Ad-EGFP组(1.30±0.04),P<0.05,而Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。同时对各组HSCs中Bcl-2蛋白表达的检测显示,PTEN shRNA组(1.46±0.06)较Control组(1.08±0.04)及Ad-EGFP组(1.07±0.05)显著升高,P<0.05,而Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05);⑧应用Western blot和real-time Q-PCR方法检测腺病毒感染HSCs后72 h各组HSCs中的Akt蛋白及其mRNA表达,其结果显示各组HSCs中的Akt蛋白和mRNA表达均无显著性差异(P>0.05);而应用Western blot对HSCs中p-Akt(Thr308)蛋白表达的研究显示,PTEN shRNA组(1.59±0.03)显著高于Control组(1.21±0.03)及Ad-EGFP组(1.16±0.04),P<0.05,Control组及Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05);⑨应用Western blot和real-time Q-PCR方法检测腺病毒感染HSCs后72 h各组HSCs中的ERK1蛋白及其mRNA的表达,其结果显示各组HSC ERK1蛋白及其mRNA表达均无显著性差异(P>0.05),而应用Western blot技术对HSCs中p-ERK1蛋白表达的研究显示,PTEN shRNA组(1.20±0.024)显著高于Control组(0.73±0.05)和Ad-EGFP组(0.81±0.04),P<0.05,Control组与Ad-EGFP组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:本实验将靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒成功感染体外培养的活化HSCs;PTEN shRNA可促进体外活化的HSCs的增殖加快,凋亡减少,并可引起凋亡调控基因Bax表达下调,Bcl-2表达上调;同时可Akt和ERK的磷酸化水平增加,提示PTEN可能通过影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路而在调控HSC增殖、凋亡中发挥着重要的作用。