第一部分中国汉族人群TNF和GRN基因多态性与强直性脊柱炎的关联性研究研究背景脊柱关节炎(spondyloarthritis,SpA)是一组具有共同临床特点和遗传学特征的慢性炎症性疾病。强直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis,AS)是SpA最常见的表现形式。家族聚集性是AS的重要特征。人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-B27是迄今为止所发现与AS关联性最强的基因。但近年来的研究发现,非HLA-B27基因在AS发病中亦具有重要作用。因此,为进一步明确AS的病因及发病机制,有必要探讨非HLA-B27基因在AS发病中的作用。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymophisms,SNP),是指单个核苷酸在基因组水平上发生变异所导致的DNA序列多态性。由于SNP广泛存在于各人群的基因组中,且易于分型,目前业已成为现代遗传变异与复杂性状研究中的最重要研究对象。肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)基因,位于6p21.33,是一种非HLA的MHC基因。该基因编码一种属于肿瘤坏死因子超家族的、主要由巨噬细胞分泌的促炎细胞因子。它可以与TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR受体结合,从而发挥作用。TNF与包括自身免疫病在内的多种疾病有关。近来的研究表明TNF在AS发病机制中具有重要作用。关于TNF是脊柱关节炎的关键细胞因子的最有力证据是,在临床中使用TNF抑制剂可以有效改善脊柱关节炎(包括强直性脊柱炎)患者的症状和体征。从组织水平上,TNF抑制剂可以引起一系列的组织学改善,包括减少中性粒细胞和巨噬细胞的炎性浸润、减少新骨形成等。既往已有诸多关于TNF基因的SNP与AS相关性的研究,但是存在争议。因此,有必要进一步研究TNF的SNP与AS的关系。GRN基因即颗粒蛋白前体(granulinprecursor,PGRN)基因,位于17q21.31,其功能为编码颗粒蛋白(granulin,GRN)前体。这种信号肽切割后产生成熟的颗粒蛋白,可以进一步裂解成6kDa的各种活性肽。这些肽和完整的颗粒蛋白调节细胞生长。然而,颗粒蛋白家族的不同成员可以作为抑制剂、激动剂或对细胞生长具有双向调节作用。近年来,颗粒蛋白被认为与许多自身免疫性疾病有关。有研究提示颗粒蛋白前体是炎症的关键调节因子,其抗炎作用可能是通过阻断TNF与其受体的结合来实现。还有研究发现PGRN抗体阳性的银屑病关节炎(PsA)患者,发生肌腱附着点炎和指(趾)炎的几率较高。AS和PsA均属于血清阴性脊柱炎(SpA),因此同时研究TNF和GRN基因多态性是否与AS相关具有重要意义。基于以上观点,为探讨TNF和GRN基因在AS发病机制中的潜在作用,我们选择了TNF和GRN基因的多个SNP位点,为AS的易感基因评估提供依据。研究目的探讨TNF、GRN基因单核苷酸多态性与我国山东地区汉族人群强直性脊柱炎(AS)的关联性。研究方法1.研究对象病例组选取861例AS患者,均属于中国山东地区汉族人群,为2014年1月至2015年12月在山东大学附属山东省立医院风湿免疫科门诊或病房的符合1984年修订的纽约AS分类标准的患者。记录患者的症状、体征、受累关节、家族史;采用流式细胞术测定HLA-B27;所有患者均完成骶髂关节X线检查,由影像科专业医师按骶髂关节的国际统一分级标准进行结果判定。所有患者均需排除其他自身免疫性疾病。正常对照组864例均来自于本研究中心体检中心健康中国山东汉族人群,已排除肿瘤、其他结缔组织病、传染病等疾病,年龄、性别均与AS组匹配。所有入选者均在知情同意后入组。2.实验方法2.1标本收集用EDTA抗凝管采集AS患者和对照组人群空腹外周静脉血2ml,放置冰箱中在-80℃条件下保存,备检。2.2基因组DNA提取使用基因组DNA提取试剂盒,按照说明书操作步骤提取病例组和对照组DNA。2.3DNA浓度和纯度测定向DNA样本2ul中加入三蒸水48ul,将浓度稀释至1/25,用紫外分光光度仪测量OD260/OD280比值以及DNA浓度,并分析DNA纯度。2.4多态性位点的选择根据dbSNP数据库获取TNF、GRN基因的SNPs资料,各个SNP位点的分布频率由HaploView软件来确定,同时应用Tagger功能筛选TagSNP。初步筛选需满足次要等位基因频率