不管是急性肝衰竭还是慢性肝衰竭，尚无哪一种治疗方法能够达到满意的疗效。人工肝、原位肝移植、肝细胞移植等治疗方法已经用于临床很长时间，但由于种种因素限制了它们的应用，如费用高、供体来源缺乏、长期服用免疫抑制剂等。这种状况迫使人们去寻找更为有效和经济的新方法。 90年代，造血干细胞的临床应用逐渐开展起来，如地中海性贫血、白血病、实体瘤大剂量化疗或／和放疗后的造血恢复。在造血干细胞的临床应用和研究中，人们发现骨髓干细胞具有多向分化潜能，在一定环境下，可以转化为其它类型的成熟细胞如神经细胞、骨骼肌细胞等，人们推测骨髓中的干细胞可能是一个复杂的群体，具有不同的分化潜能和方向。 1999年有人报道骨髓造血干细胞可以转化为肝细胞。如果能使患者自身骨髓干细胞增殖和向肝细胞选择性分化，我们便可以用自身骨髓干细胞分化和增殖来替代肝脏功能，同时又能解决异体移植的供体来源缺乏及免疫排斥的问题，具有广阔的应用前景。 有人在骨髓细胞中分离出一类β₂m^-／Thy-1⁺细胞，具有肝细胞的一些表型如白蛋白mRNA表达，并在体外诱导分化，出现新的肝细胞表型如CAM5.2，因此这类β₂m^-／Thy-1⁺细胞可能是骨髓中的“肝脏干细胞”，骨髓中肝脏干细胞还有那些肝细胞特征，有必要进一步研究。 在骨髓细胞向肝细胞的转化实验中，常用射线照射去除受体动物自身骨髓，使供体骨髓细胞能大量的在受体骨髓腔定居、增殖。在二乙酰 郑州大学2002届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究氨基拐（2－AAF）加 CCI。肝损伤模型中，己经发现移植的骨髓细胞可以转变为肝细胞和 AFP用 脏前体细胞，也有人用小剂量的全身照射，证明在无肝损伤的情况下，也有骨髓细胞向肝细胞的转化。虽然在体内研究中，骨髓细胞在肝脏中可以转化为肝细胞，但其机制尚未阐明，推测细胞因子和肝脏局部微环境起着重要作用。 本研究用3种动物模型进行交叉性别骨髓移植，探讨在不同条件下，骨髓细胞向肝细胞转化的情况，并分析2－AAF对骨髓细胞转化率的影响。 联合双向聚丙烯酚胺凝胶电泳 Q．PAGE)及质谱（MS）进行蛋臼质组研究是目前广泛应用的方法，这一技术可以比较不同的细胞或组织蛋白质组的差异，对于研究细胞的分化、肿瘤、衰老具有重要意义。为此，我们初步在本实验室建立ZD－PAGE实验技术，对2．AAF＋PH（部分肝切）模型肝切前后的肝组织的总蛋白进行分离，并找出肝切前后的差异蛋白质点，希望从中找到促使肝脏干细胞活化和骨髓干细胞向肝细胞转化的细胞因子。 材料 禾方法： 本实验用免疫组化、逆转录PCR和 Western blot方法，对骨髓细胞甲胎蛋自mRNA和蛋白的表达进行分析，以确定骨髓细胞中肝脏干细胞标志一甲胎蛋白的表达情况。用逆转录PCR、巢式PCR和基因序列测定检测骨髓细胞中白蛋白mKNA表达情况。 分离大鼠骨髓单个核细胞，分3组进行培养：l)单纯培养基对照组，（含胎牛血清15％人2）大鼠肝损伤血清组（用2－＊AF十＊H肝切模型大鼠肝切后；血清替代胎牛血清人 3）HGF组＊牛血清 1％，加肝细胞生长因子 20ng／mL人用免疫组化、逆转录 PCR和 Western blot方法，以观察大鼠肝损伤血清和 HGF对骨髓细胞转化的促进作用。 将雌性 SD大鼠随机分为 3组，每组 15只。l)R＋BMT（全身照射＋骨髓移植＼ 2）2－AAF＋R＋BMT；3)2．AAF＋PH＋BMT。2．AAF采用灌胃法。各组进行交叉性别骨髓细胞移植，将雄性骨髓移植入雌性受体内，以雄性性别诀定基因 sry作为细胞标记，用原位杂交和 FISH作为检测方 2 郑州大学2O02届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究 法进行骨髓细胞向肝细胞转化的分析。 用雌性SD大鼠6只，做2－AAF＋PH模型，进行肝切前后肝脏蛋白质 ZD．PAGE电泳，分析蛋白差异。 结果显示： 1．PCR移植效果初步分析可见，R＋BMT组门例中有 10例 PCR阳性； ZAAF＋PH＋BMT组门例中有 7例阳性，ZAAF＋R＋BMT组 10例中有 6例阳性。 2．sry原位杂交染色发现，第5大各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝 细胞。 3．第 10大 R＋BMT组可见一例 Sry阳性的细胞位于肝细胞索，FISH染色可 见这一细胞白蛋白mKNA阳性。 4．第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到Sry阳性的细胞。FISH 染色可见白蛋白mRNA阳性。 5．经统计学分析第20大各组Sry阳性细胞数无明显差异(P＞0刀5人 6．AFP兔疫组化染色可见，新鲜骨髓细胞和单纯 IMDM／F培养基组呈阴 性；肝损伤血清组和 HGF组培养后 10． 20天，细胞爬片 AFP免疫组化 染色阳性。 7．AFP