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目的:研究胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)在肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染中发挥的作用;探究EVs穿越血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的具体机制及其对中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染的影响。方法:(1)通过密度梯度离心法提取EV71病毒感染细胞上清中的EVs,利用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、粒径分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)和Western-blot(WB)对其进行鉴定。(2)利用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd3和小鼠原代星形胶质细胞在体外构建血脑屏障模型,使用辣根过氧化物酶(HRP)与荧光素钠(FLU)检测血脑屏障的通透性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EV71 RNA,比较含有EV71病毒RNA的EVs(后续称EVs)和不含EVs的EV71病毒颗粒(后续称EV71)穿越体外血脑屏障的效率。(3)利用免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)分别检测EVs与小窝蛋白介导转胞吞作用的标志物Caveolin-1、巨胞饮作用的标志物Dextran与网格蛋白介导转胞吞作用的标志物Transferrin的共定位;使用氯丙嗪(Chlorpromazine)、阿米洛利(Amiloride)和制霉菌素(Nystatin)分别抑制小窝蛋白介导的转胞吞作用、巨胞饮和网格蛋白介导的转胞吞作用后,利用流式细胞术(Flow Cytomertor,FCM)检测脑微血管内皮细胞bEnd3对EVs转胞吞作用的变化,探究EVs穿越血脑屏障的具体机制。(4)通过ELISA检测EVs穿越体外血脑屏障后,血脑屏障中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)表达水平的变化。在血脑屏障模型中加入PI3K抑制剂LY294002后,利用FCM检测脑微血管内皮细胞bEnd3对EVs转胞吞作用的变化,利用IF检测脑微血管内皮细胞bEnd3中密封蛋白-5(claudin5)、闭合蛋白(occludin)与闭锁连接蛋白-1(zonulaoccluden 1,ZO-1)的表达变化,探究PI3K信号通路与血脑屏障紧密连接的关系。(5)分别使用EVs和EV71腹腔注射感染一日龄ICR小鼠,评估动物模型的发病情况和死亡率,病理切片观察脑组织病变程度,通过qRT-PCR检测脑组织与肠组织中病毒RNA的水平,比较EVs和EV71对动物模型的感染情况。ELISA检测动物模型脑组织中PI3K的表达,通过WB与IF检测脑组织紧密连接蛋白ZO-1与星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化,探究EVs和EV71感染动物模型与穿越血脑屏障的相关性。(6)提取并鉴定EV71患者血浆和粪便中的EVs,qRT-PCR检测EV71患者血浆和粪便中EVs内EV71 RNA的水平,探究EVs与临床的相关性。结果:(1)EV71感染的RD细胞分泌大量含有病毒RNA的EVs,且可以感染其他细胞,电镜显示有大量不含病毒颗粒的EVs和少量含有完整病毒颗粒的EVs。(2)血脑屏障功能实验的结果显示,已成功建立体外血脑屏障模型。在体外血脑屏障模型中,EVs的穿越效率明显高于EV71(P<0.001)。(3)EVs和Caveolin-1、FITC-Dextran与FITC-Transferrin的共定位表明EVs可同时通过小窝蛋白介导的转胞吞作用、巨胞饮和网格蛋白介导的转胞吞作用穿越体外血脑屏障。不同转胞吞途径的抑制剂Chlorpromazine,Amiloride和Nystatin能够不同程度地抑制EVs穿越体外血脑屏障,但巨胞饮作用抑制剂Amiloride抑制效果最为明显,表明EVs主要通过内皮细胞的巨胞饮作用穿越体外血脑屏障。(4)EVs穿越体外血脑屏障后,能够感染星形胶质细胞且使血脑屏障中的PI3K表达水平降低(P<0.001)。使用LY294002抑制了血脑屏障的PI3K信号通路后,脑微血管内皮细胞bEnd3对EVs的转胞吞作用没有变化,但脑微血管内皮细胞bEnd3紧密连接蛋白ZO-1、claudin5和occludin的表达下调。(5)动物模型中,EVs感染组小鼠体重较轻(p<0.05),死亡率更高,EVs感染组的脑组织病变更加明显,且脑组织与肠组织病毒RNA水平高于EV71感染组(P<0.001)。EVs感染小鼠后,脑组织的PI3K表达水平降低(P<0.01),星形胶质细胞标志物GFAP的表达水平降低,脑微血管内皮细胞的紧密连接蛋白ZO-1表达下调。(6)EV71重症患者血浆中可分离出含有EV71 RNA的EVs。结论:(1)EV71感染细胞释放含有病毒核酸的EVs,且具有感染性,其中的少部分EVs可以包裹完整的EV71病毒颗粒。(2)EVs可以通过转胞吞作用穿越体外血脑屏障,且以巨胞饮的方式为主。EVs穿越血脑屏障后感染星形胶质细胞,抑制了血脑屏障中的PI3K信号通路,进一步破坏了血脑屏障的紧密连接结构。(3)EVs感染的动物模型以及临床标本的检测,表明EVs穿越血脑屏障的特性可能与EV71感染中枢神经系统有关。