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研究背景：流行病学调查显示：饮酒和2型糖尿病之间存在着U型关系,也就是说适量饮酒对抵抗2型糖尿病的发生发展发挥有益的作用,而长期大量饮酒则增加2型糖尿病发病的危险性。同时,高脂饮食导致了游离脂肪酸增加,胰岛beta细胞功能下降,对葡萄糖的反应性下降以及细胞摄取葡萄糖减少,从而引起了胰岛素分泌障碍和胰岛素分泌减少,引发和推进糖尿病的”脂毒性”。由此可见,无论是过量摄入酒精还是高脂饮食均能损害胰岛功能,均是2型糖尿病发病的常见独立危险因素。目前,国内外的研究也多关注在饮酒或高脂这两个因素单独对糖尿病的影响而很少将二者放在一起比较。但是我们的日常生活中,人们在饮酒的同时也摄入了大量脂肪,那么这两种因素同时存在时又会对2型糖尿病的发病产生怎样的影响?我们前期的研究发现适量饮酒改善高脂诱发的脂肪胰岛素抵抗。由此,我们产生疑问：高脂环境下,适量酒精对2型糖尿病发生的中心环节--β细胞作用如何?腺苷酸环化激酶(AMPK)作为机体的能量检测器,密切观察细胞的能量状态。现在对于AMPK的作用已经基本肯定的是促进外周对葡萄糖的摄取；促进脂肪氧化；抑制肝脏的脂肪酸和胆固醇合成；抑制脂肪细胞的脂肪酸合成和甘油三酯分解。在胰岛β细胞,葡萄糖是可以通过氧化代谢直接改变细胞内的腺苷酸水平来影响AMPK的活化,表现为高糖抑制AMPK的活性。那么,酒精和/脂肪酸是否通过AMPK影响胰岛素的分泌呢?胰腺十二指肠同源异型盒因子-1(PDX-1)是胰腺发育和胰岛素启动子的重要的转录因子,能进入细胞核与胰岛素基因相结合引起胰岛素的mRNA转录,对beta细胞内分泌功能起重要调控作用。而葡萄糖转运蛋白2 (GLUT2)则隶属于葡萄糖转运蛋白家族(GLUTs),能催化血中葡萄糖转运,促进葡萄糖进入胰岛beta细胞内,与葡萄糖激酶(GCK)共同形成葡萄糖感受器,调节胰岛beta细胞的胰岛素分泌,主要受PDX-1的转录调控。PDX-1和GLUT2表达上调可以促进胰岛素释放和含量。本实验旨在观察酒精,饱和游离脂肪酸(棕榈酸)以及二者合用时(酒加脂)分别对胰岛β细胞(INS-1细胞)功能的影响,从胰岛素分泌量,调节胰岛素基因关键分子PDX-1及其下游葡萄糖转运分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白表达这几个方面评价INS-1细胞的功能。目的：1.观察酒精,棕榈酸以及二者合用时(酒加脂)对胰岛β细胞(INS-1细胞)胰岛素释放功能的影响。2.观察酒精,棕榈酸以及二者合用时(酒加脂)对胰岛β细胞(INS-1细胞)中调节胰岛素基因关键分子PDX-1及其下游葡萄糖转运分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白水平的影响。方法：1.INS-1细胞在含10%胎牛血清、1OOU/ml青霉素、0.1 mg/mL链霉素、50μMβ-巯基乙醇、0.133 g/L丙酮酸钠的RPMI1640培养液在37℃、5%C02培养箱内培养。当细胞融合80%-90%时用胰酶消化后接种于细胞培养皿(106个/皿)或24孔板(2×105个/孔)中,48h时分组处理。分为六个组：正常对照组,20 mmol/L乙醇(20 mmol/L EtOH)组,100 mmol/L乙醇(100 mmol/L EtOH)组,0.2 mmol/L棕榈酸(PA)组,PA+20 mmol/L EtOH (PA+20 mmol/L EtOH)组和PA+100 mmol/L EtOH(PA+100 mmol/L EtOH)组,孵育48h用于后续实验。2.胰岛素释放实验：INS-1细胞种于24孔板中,分组处理后,在葡萄糖浓度为3.3mmol/l、27.8 mmol/L的KRB缓冲液中分别37℃孵育40分钟,收集上清液,放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。3. PDX-1、GLUT2、AMPK的检测：在INS-1细胞上Westernblotting检测PDX-1、GLUT2、AMPK蛋白水平表达。结果：1.不同处理因素对INS-1细胞胰岛素分泌的影响与对照组的基础胰岛素量(BIS)相比,除了PA组BIS显著增加了48%外,其余各组BIS均无明显差异；与PA组相比,只有100 mmol/L EtOH组BIS显著降低。与对照组葡萄糖刺激的胰岛素释放量(GSIS)相比,20 mmol/L EtOH(模拟适量饮酒)和PA+20 mmol/L EtOH两GSIS都没有明显变化；100 mmol/L EtOH(模拟大量饮酒)组GSIS减低了43%；PA组和PA+100 mmol/L EtOH组GSIS分别下降了41.5%和48%。与PA组相比,PA+20 mmol/L EtOH组GSIS明显增加(增加68.2%),而PA+100 mmol/L EtOH组没有发现增加胰岛素释放的现象。相应地,图1还显示相对于对照,20 mmol/L EtOH组和PA+20 mmol/L EtOH组的胰岛素分泌指数(ISI)没有显著变化,而100 mmol/L EtOH组,PA组和PA+100mmol/L EtOH组的ISI则分别降低了36.3%,47%及41.6%。由此可见与酒精相比,PA对ISI的影响更明显。相对于PA组,PA+20 mmol/L EtOH组的ISI显著升高了47.1%,而PA+100 mmol/L EtOH组则没有明显差异。2.2不同处理组INS-1细胞PDX-1表达的变化结果显示与胰岛素释放实验相一致,与对照相比,20 mmol/L EtOH组和PA+20 mmol/L EtOH组无明显影响；100 mmol/L EtOH组,PA组以及PA+100 mmol/LEtOH组PDX-1水平明显降低,分别下降了21.5%(*p<0.05),30%(*p<0.05)和23%(*p<0.05)。由此可见,与两个酒精组相比,棕榈酸(PA)组对细胞影响更大(其中PA组PDX-1比20 mmol/L EtOH组表达量减低更显著,#p<0.05)。而PA+20mmol/L ETOH和PA+100mmol/L ETOH两个酒加脂组的PDX-1蛋白表达又比棕榈酸组分别增加28%(#p<0.05)和8%(#p>0.05)。(见图2)2.3检测不同处理组INS-1细胞GLUT2表达的变化为了进一步验证问题,本实验同时观察作为PDX-1的下游因子GLUT2的变化趋势。图3显示,与对照组相比,100 mmol/L EtOH组,PA组和PA+20 mmol/L EtOH组GLUT2水平分别降低了17.6%(*p<0.05),37.5%(*p<0.05)以及30.9%(*p<0.05)。且从下降幅度来看,与两个酒精组相比,INS-1细胞对棕榈酸反应性更敏感。而与PA组相比时,PA+20mmol/L EtOH组的GLUT2蛋白水平则增加35.4%(#p<0.05),而0.2PA+100mmol/L ETOH组的蛋白表达没有明显的升高。2.4不同处理组INS-1细胞AMPK表达的变化相对于对照组,100 mmol/L EtOH组,PA组以及PA+100 mmol/L EtOH组T-AMPK表达分别降低了17.5%,(*p<0.05),26.7%(*p<0.05)和20.7%(*p<0.05),而其余组对T-AMPK没有显著影响。且相对于两个酒精组,PA组的T-AMPK表达更低。相对于PA组,PA + 20 mmol/L EtOH组的T-AMPK的表达明显改善(#p<0.05)。图4显示除了PA组AMPK活化(P-AMPK/T-AMPK)相对于对照组显著降低(下降18%,*p<0.05)以外,其余各组的AMPK活化均无统计学差异。且当PA和适量酒精(20 mmol/L ETOH)共培养时,改善了由PA引起的AMPK活化降低(#p<0.05)。而大量酒精(100 mmol/L EtOH)与PA合用时,却没有出现明显的改善现象。结论：1.大量酒精和PA均能抑制高糖刺激的胰岛素释放并且下调PDX-1和GLUT2的蛋白表达水平；大量酒精下调T-AMPK的表达但对AMPK活化(P-AMPK/T-AMPK)无影响,而PA不仅下调T-AMPK也损害AMPK的活性。2.酒加脂的情况下,适量酒精(20 mmol/L EtOH)能够改善由棕榈酸引起的胰岛β细胞功能损伤；而大剂量酒精无此作用。