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研究背景和目的阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种有效的癌症化疗药物。阿霉素对心脏有一定的副作用-剂量依赖性心肌损伤,严重的导致心力衰竭,甚至死亡;这种心肌损伤的机制与能量代谢障碍、凋亡、氧化应激和纤维化等有关。有氧运动作为一种非药物手段可以有效的预防和缓解阿霉素诱导的心肌损伤,但其作用机制至今尚未完全阐明。一般性调控阻遏蛋白激酶2(general control non-derepressible 2,GCN2)是真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α,eIF2α)激酶的其中之一,是氨基酸感应激酶。前期研究表明GCN2活性的降低和缓解小鼠心血管疾病有关,GCN2及其下游eIF2α/ATF4通路在其中起着重要作用,但是GCN2基因在有氧运动减轻阿霉素诱导的心肌损伤的过程中所起的作用尚不清楚。因此本研究将使用阿霉素诱导的小鼠心肌损伤模型,采用中等强度的跑台运动干预,研究阿霉素注射期间和之后的中等强度的有氧运动对小鼠心肌损伤的影响,并探索对GCN2及其下游通路(eIF2α/ATF4)的影响。本研究将使用GCN2基因敲除小鼠进行同样的阿霉素注射和有氧运动干预,研究GCN2基因敲除后是否影响有氧运动对阿霉素诱导的小鼠心肌损伤的调节作用;同时还采用GCN2激活剂观察GCN2激活是否影响有氧运动调节阿霉素诱导的小鼠心肌损伤的作用。本研究将揭示有氧运动减轻心肌损伤的作用机制以及GCN2在其中所起的作用。研究方法和材料第一部分:有氧运动对阿霉素诱导的C57小鼠心肌损伤的影响和对GCN2的影响1.8周龄的雄性C57小鼠(n=36)随机分配到C57对照组(C57 CON,n=6)、C57注射阿霉素组(C57 DOX,n=12)、C57运动组(C57 E,n=6),C57注射阿霉素运动组(C57 DE,n=12)。注射阿霉素方案共进行4周,每周注射一次,每次注射5mg/kg,总剂量为20mg/kg,对照组小鼠注射等量的生理盐水。2.有氧运动训练方案采用8周的中等强度的跑台训练。DE组小鼠前4周注射阿霉素和运动训练同时进行,后4周只进行有氧运动训练。8周有氧运动训练结束后进行超声心动图测试,评估小鼠的心功能,包括心脏射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)等。24小时后对小鼠进行运动能力测试,包括最大运动距离和运动时间。3.麻醉小鼠并获取小鼠心脏组织,对心脏组织进行组织学测试,包括使用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)染色观察心肌细胞大小变化,使用天狼星红(Sirius Red)染色观察心肌组织纤维化水平。4.对小鼠心肌组织进行分子生物学测试,包括GCN2蛋白及其下游通路(eIF2α、P-eIF2α、ATF4)、心肌凋亡相关蛋白(Caspase3、Bax、Bcl2)、心功能相关蛋白(ANP)、心肌能量代谢相关蛋白(AMPKα、P-AMPKα、PGC1α、SIRT1)和纤维化相关蛋白(CollagenI)的表达。第二部分:有氧运动对阿霉素诱导的GCN2基因敲除小鼠心肌损伤的影响和机制1.8周龄的雄性GCN2基因敲除小鼠(GCN2 KO,n=36)随机分配到GCN2基因敲除对照组(GCN2 KO CON,n=6)、GCN2基因敲除阿霉素组(GCN2 KO DOX,n=12)、GCN2基因敲除运动组(GCN2 KO E,n=6),GCN2基因敲除注射阿霉素运动组(GCN2 KO DE,n=12)。2.该部分实验方法和测试指标与第一部分相同,主要研究GCN2基因敲除是否影响有氧运动对阿霉素诱导的小鼠心肌损伤的调节作用,并研究其相关机制。第三部分:GCN2激活对有氧运动调节阿霉素诱导的小鼠心肌损伤的影响和机制1.8周龄的雄性C57小鼠(n=24)随机分配到C57注射阿霉素运动组(C57 DE,n=12)和C57注射阿霉素运动+GCN2激活剂组(C57 DEL,n=12);8周龄的雄性GCN2基因敲除小鼠(n=24)分到GCN2基因敲除注射阿霉素运动组(GCN2 KO DE,n=12)和GCN2基因敲除注射阿霉素运动+GCN2激活剂组(GCN2 KO DEL,n=12)。2.GCN2激活剂采用1周的亮氨酸缺乏(Leu~-)饮食喂养,对照组喂养普通饲料,亮氨酸缺乏饲料组成和普通饲料除了亮氨酸的含量不同之外,其余完全相同。1周的亮氨酸缺乏饮食喂养可以有效的激活GCN2。3.阿霉素注射方案和有氧运动方案与第一部分相同,并在8周有氧运动干预的最后1周进行亮氨酸缺乏饮食干预,干预结束后对小鼠进行超声心动图测试和运动能力测试。研究结果:第一部分1.相比C57安静组,C57 DOX组小鼠心脏的EF和FS的显著降低(P<0.01),最大运动距离和运动时间也显著下降(P<0.01),即注射阿霉素降低了小鼠的心功能和运动能力;从干预的第4周到第8周,C57 DOX组小鼠体重相比安静组显著较低(P<0.01);C57 DOX组小鼠心肌组织出现显著纤维化(P<0.01);C57 DOX组小鼠心脏GCN2下游蛋白(P-eIF2α/ATF4)表达显著增加(P<0.01);Bax、Caspase3和ANP蛋白表达显著增加(P<0.01),心肌抗凋亡相关的Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比率显著下降(P<0.05);能量代谢相关蛋白(P-AMPKα、PGC1α、SIRT1)表达显著降低(P<0.05);纤维化相关蛋白(Collagen I)表达显著增加(P<0.01);即阿霉素诱导了C57小鼠的心肌凋亡、能量代谢障碍和心肌纤维化。2.相比C57 DOX组,C57 DE组缓解了上述不良的症状,包括改善了小鼠EF和FS(P<0.05);改善了小鼠最大运动距离和运动时间(P<0.05);改善了小鼠心肌组织纤维化水平(P<0.05);并且抑制了凋亡和纤维化相关蛋白(Bax、Caspase3、Collagen I)的表达(P<0.05);心肌抗凋亡相关的Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比率显著升高(P<0.05);还增加了能量代谢相关蛋白(P-AMPKα、PGC1α、SIRT1)的表达,ANP蛋白表达有升高的趋势,但没有显著差异性;即有氧运动改善了阿霉素诱导的C57小鼠的心肌凋亡、能量代谢障碍和心肌纤维化。3.相比C57 DOX组,C57 DE组还抑制了GCN2和下游通路相关蛋白(P-eIF2α/ATF4)的表达(P<0.05),GCN2蛋白表达的下降可能和有氧运动的心脏保护作用相关。第二部分1.相比GCN2 KO安静组,GCN2 KO DOX组小鼠心脏的EF和FS显著降低(P<0.01);最大运动距离和运动时间也显著下降(P<0.01);从干预的第4周到第8周,GCN2 KODOX组小鼠体重相比安静组显著较低(P<0.01);GCN2 KO DOX组小鼠心肌组织出现显著纤维化(P<0.01);GCN2 KO DOX组小鼠GCN2下游通路相关蛋白(P-eIF2α、ATF4)表达显著增加(P<0.05),Bax和ANP蛋白表达显著增加(P<0.01),Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比率显著下降(P<0.05),能量代谢相关蛋白(P-AMPKα、PGC1α、SIRT1)表达显著降低(P<0.05);即阿霉素诱导了GCN2基因敲除小鼠的心肌凋亡、能量代谢障碍和心肌纤维化。2.相比GCN2 KO DOX组,GCN2 KO DE组缓解了上述症状,具体包括减轻了阿霉素诱导的GCN2 KO小鼠EF和FS值(P<0.05),改善了运动能力(P<0.05);减轻了心肌组织纤维化(P<0.05);抑制了心肌凋亡和心功能相关蛋白(Bax、ANP)的表达(P<0.05);增加了心肌抗凋亡相关的Bcl2和Bcl2/Bax比率显著升高(P<0.05);还增加了能量代谢相关蛋白(P-AMPKα、PGC1α、SIRT1)的表达;抑制了GCN2下游通路相关蛋白(P-eIF2α、ATF4)的表达(P<0.05);即有氧运动改善了阿霉素诱导的GCN2基因敲除小鼠的心肌凋亡、能量代谢障碍和心肌纤维化。3.研究还对GCN2基因敲除小鼠与C57小鼠的心肌损伤指标进行了对比,发现与C57DOX组相比,GCN2 KO DOX组小鼠的体重、运动能力、EF和FS显著较高(P<0.05),心肌纤维程度也显著较低(P<0.05),即GCN2基因敲除抑制阿霉素导致的小鼠的体重、心功能和运动能力的下降;与C57 DE组相比,GCN2 DE组小鼠的心脏EF和FS值也显著较高(P<0.05),其余指标较高,但没有显著差异性;即GCN2基因敲除能缓解阿霉素诱导的小鼠心肌损伤,且GCN2基因敲除还能促进有氧运动对小鼠心肌损伤的缓解作用,其机制和抑制GCN2的活性有关,然后抑制P-eIF2α/ATF4通路的表达,进而抑制心肌凋亡、纤维化和能量代谢障碍。第三部分1.相比C57 DE组,C57 DEL组小鼠心脏GCN2下游通路蛋白(P-eIF2α/ATF4)的表达显升高(P<0.05)。2.相比C57 DE组,C57 DEL组小鼠的运动能力显著下降(P<0.05);EF和FS显著降低(P<0.05);心肌纤维化程度有升高的趋势,但没有差异性;即GCN2激活导致了C57 DE组小鼠的体重、心功能和运动能力的下降;相比GCN2 KO DE组,GCN2 KO DEL组小鼠体重显著降低(P<0.05),EF、FS和运动能力有下降的趋势,但没有显著差异性;心肌纤维化程度也有升高的趋势,但没有显著差异性。3.相比C57 DEL组,GCN2 KO DEL组小鼠的体重没有显著差异性;EF和FS较高,但没有显著差异性;运动能力显著较高(P<0.05);心肌纤维化程度显著较低(P<0.05);GCN2下游蛋白(P-eIF2α/ATF4)的表达也显著较低(P<0.05)。研究结论1.8周的有氧运动缓解了阿霉素诱导的C57小鼠的心肌损伤,机制和调节心肌凋亡、能量代谢障碍和纤维化相关蛋白的表达有关;有氧运动还抑制了GCN2蛋白及其下游P-eIF2α/ATF4的表达,GCN2蛋白表达下降和有氧运动减轻心肌损伤有关。2.GCN2基因敲除后缓解了阿霉素诱导的小鼠心肌损伤,并促进有氧运动对阿霉素诱导的心肌损伤的缓解效果,其机制与抑制GCN2蛋白表达,调控下游P-eIF2α/ATF4通路,进而影响小鼠心肌凋亡、能量代谢和纤维化有关。3.GCN2激活抑制有氧运动对C57小鼠心肌损伤的改善作用,GCN2是有氧运动缓解阿霉素诱导的心肌损伤的重要基因,其下游通路(P-eIF2α/ATF4)在该过程中起着重要作用。