糖尿病、高胆固醇血症、高血压，动脉粥样硬化和冠状动脉疾病的发病率逐年增加，其血管并发症可引起机体严重损害甚至危及生命。I型和II型糖尿病患者内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）数量减少，功能受损，当同时伴有高脂血症，心血管疾病和心血管危险因素，诸如高血压和吸烟等危险因素时，EPCs数量将进一步减少，功能进一步受损[1-4]。II型糖尿病患者常伴有高脂血症，高血脂可引起血浆内氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）积聚[5]。溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）是Ox-LDL的主要成分。许多研究表明，LPC可诱导成熟内皮细胞凋亡[6]；抑制成熟内皮细胞迁移和增殖[7]；在动脉粥样硬化早期趋化单个核细胞向动脉壁募集[8]；诱导成熟内皮细胞表达白细胞粘附分子[9]；诱导创伤反应中成熟内皮细胞表达促进平滑肌细胞和成纤维细胞迁移和增殖的生长因子[10]；抑制成熟内皮细胞内皮素-1（endothelin-1, ET-1）的产生[11]。LPC通过与分化中的单个核细胞表面的G蛋白偶联受体反应，促进成熟树突状细胞的产生[12]。但是LPC对于从人CD34+造血干细胞向早期内皮祖细胞（early endothelial progenitor cell，early EPC）分化会产生哪些作用尚不清楚。1.人CD34+造血干细胞的体外分离与扩增目的：为了从健康人外周血中分离CD34+造血干细胞，并且可以使其在体外有效扩增，得到一定数量的CD34+造血干细胞。方法：我们通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs）、免疫磁珠分离CD34+造血干细胞、流式细胞仪（FACS）分析CD34+造血干细胞纯度，采用无血清Stem II造血干细胞培养基并添加有效刺激因子在超低粘附6孔细胞培养板上悬浮培养扩增CD34+造血干细胞。结果：使用CD34+免疫磁珠筛选细胞后，约有70%的细胞表面表达CD34分子；使用Corning超低粘附6孔细胞培养板，CD34+造血干细胞在无血清的Stem II培养基中加入rh-SCF（100ng/ml），rh-FLT-3L（50ng/ml），rh-IL-3（20ng/ml），rh-TPO（100ng/ml），rh-GCSF（100ng/ml），于细胞培养箱中37℃，5%CO2条件下培养8天，细胞数量平均扩增了60倍（59.4±4.1, Mean±SD, n=9）。结论：应用无血清的造血干细胞培养基添加有效的刺激因子悬浮培养CD34+造血干细胞是一种有效的CD34+造血干细胞体外扩增的方法，此方法可以得到一定数量的CD34+造血干细胞。2. LPC对人CD34+造血干细胞向early EPC分化的影响2.1人CD34+造血干细胞向early EPC分化目的：在体外应用内皮细胞培养基诱导人CD34+造血干细胞向early EPC分化。方法：将体外扩增得到的CD34+造血干细胞接种到纤维连接蛋白（fibronectin, FN）包被的细胞培养板中，加入内皮细胞培养基（Endothelial Cell Growth Medium-2, EGM-2），培养3-4天，将不贴壁的细胞弃掉，加入新鲜EGM-2，继续培养3-4天。流式细胞仪（FACS）分析early EPC表型。细胞免疫荧光染色鉴定early EPC表达内皮细胞特异性标志物。结果：由CD34+造血干细胞在体外诱导分化的early EPC呈现贴壁的纺锤样形态；early EPC表面表达CD31和KDR分子，但CD34分子的表达水平较低；经免疫荧光染色后，在early EPC表面表达内皮细胞特异性标志物：血管内皮钙粘蛋白（Vascularendothelial-caherin, VE-Cadherin），血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)和内皮一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）。结论：CD34+造血干细胞在体外可以诱导分化得到early EPC；这些early EPC表面表达内皮细胞特异性的标志物CD31，KDR，VE-Cadherin，vWF和eNOS。2.2LPC对CD34+造血干细胞来源的early EPC基因表达的影响目的：检测LPC是否影响CD34+造血干细胞向early EPC分化及其作用机制。方法：在CD34+造血干细胞向early EPC分化的晚期阶段于细胞培养液中加入LPC（10ug/ml），继续培养1h，5h及24h后，收集细胞样品，施行实时定量RT-PCR检测血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）、血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1），趋化因子CCL2（chemokine CCL2，CCL2）及白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）的基因表达情况。结果：以10ug/ml的LPC或10ug/ml的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）处理early EPC，并继续培养1h后，VEGF, Ang-1和CCL2基因表达水平在阴性对照组，LPC组和PC组，各组之间比较没有统计学差异；IL-8基因表达水平在LPC组和阴性对照组间比较有统计学差异（p<0.05）,表现为IL-8基因表达水平上调。以10ug/ml的LPC或10ug/ml的PC处理early EPC，并继续培养5h后，VEGF，CCL2和Ang-1基因的表达水平在阴性对照组，LPC组和PC组，各组之间比较没有统计学差异； IL-8基因表达水平在LPC组和对照组间比较有统计学差异（p<0.05），表现为IL-8基因表达水平上调。以10ug/ml的LPC或10ug/ml的PC处理early EPC，并继续培养24h后，VEGF, CCL2和IL-8基因表达水平在阴性对照组，LPC组和PC组，各组之间比较没有统计学差异。Ang-1基因表达水平在LPC组和对照组间比较有显著差异（p<0.01），表现为Ang-1基因表达水平下调；Ang-1基因表达水平在LPC组和PC组间比较有统计学差异（p<0.05），表现为Ang-1基因表达水平下调。结论：LPC影响CD34+造血干细胞来源的early EPC促血管生成基因的表达,表现为Ang-1基因表达下调；LPC影响CD34+造血干细胞来源的early EPC促炎症基因的表达，表现为IL-8基因表达上调。2.3LPC对CD34+造血干细胞来源的early EPC促进内皮细胞（human umbilical veinendothelial cells，HUVECs）在体外形成小管网络结构能力的影响目的：检测LPC是否影响CD34+造血干细胞来源的early EPC促进内皮细胞（HUVECs）在体外形成小管网络结构的能力。方法：使用MatrigelTM，利用HUVECs(passages P3–P5)和early EPC的共培养系统评估经过LPC处理或未经处理的early EPC支持HUVECs在体外形成小管网络结构。结果：在体外，单独early EPC本身不能形成小管结构；但这些early EPC具有促进内皮细胞(HUVECs)形成小管网络结构的能力，表现为early EPC可以促进内皮细胞(HUVECs)形成完整的小管网络结构；经过LPC处理后，early EPC促进内皮细胞(HUVECs)形成小管网络结构的能力减弱，表现为由HUVECs和early EPC形成的部分小管网络结构松散，不完整。结论：CD34+造血干细胞来源的early EPC具有促进内皮细胞（HUVECs）在体外形成小管网络结构的能力；LPC可以抑制early EPC的这种在体外促进内皮细胞血管生成的能力。