冷冻胁迫对荧光假单胞菌致病性和致腐性的影响及机理初探

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荧光假单胞菌属于假单胞菌属,是好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌,经常与许多食品的变质有关,是牛乳及其制品和冷冻生鲜食品中常见的污染菌。冷冻冷藏作为食品行业重要的保藏手段可以一定程度降低微生物的生物活性,延长保质期,然而一旦冷链中断或温度失控,残存的细菌将迅速恢复生长繁殖及致病能力,所以长期低温并不能消除微生物的致病性,致病风险甚至可能增加,在食品安全方面带来极大的危害。因此,本文就冷冻胁迫后荧光假单胞菌适温恢复过程中致病性、致腐性变化情况及其机制进行了研究。本研究首先采用一步数值分析法同时整合了动态和静态温度条件下荧光假单胞菌在鱼汁中的生长和存活情况,构建了不同温度下鱼汁中荧光假单胞菌的生长预测模型,得到相关参数a、Y max和T min的估计值分别为1.386×10-3、8.431Log CFU/m L和-4.68℃。根据得出的残留误差(ε)值,本研究构建的模型可以准确地预测加工、存储和零售过程中受污染的鱼汁中荧光假单胞菌的生长和进行风险评估。其次,本文研究了冷冻胁迫对荧光假单胞菌致病性的作用效果。通过绘制低温刺激后荧光假单胞菌在适温(30℃)恢复过程中的生长曲线,发现经冷冻胁迫的荧光假单胞菌在适温恢复2或4个小时后生长能力会显著增强。此外,结晶紫黏附实验结果表明冷冻胁迫3、6、9天后荧光假单胞菌在适温恢复3-5h生物被膜形成能力增强,琼脂糖凝胶电泳和Dot Blot结果为冷冻胁迫6、9天后荧光假单胞菌e DNA和PIA分泌量相应提高了57.8%-76.4%和14%-17%。通过研究荧光假单胞菌对兔血的溶血效果发现冷冻胁迫后其溶血活性增强。通过体外胃肠道模拟考察了荧光假单胞菌经过胃肠道后的存活情况,结果表明经冷冻胁迫后存活率提高,说明对胃肠道的适应性增强,从而有可能对人体产生更强的致病性。最后,本文对冷冻胁迫后荧光假单胞菌致腐性的变化及其机制进行了初步探究。通过脱脂乳平板和半固体培养基发现冷冻胁迫后荧光假单胞菌的胞外蛋白酶产量、群集性和泳动性均有增强。采用q RT-PCR法考察了冷冻胁迫对致腐蛋白相关基因的调控作用,结果显示经冷冻刺激3、6、9天的荧光假单胞菌适温恢复6h后基因fur的表达量增加为原来的1.77、19.16、19.16倍,冷冻6、9天恢复6h后clp P的表达量增加了2.94和1.06倍,说明冷激可能通过上调这些基因从而促进荧光假单胞菌的致腐能力。最后利用报告菌株CV026和GC-MS对QS信号分子AHLs的产量变化进行了定性和定量检测,发现冷激后信号分子产量均高于未经冷激的,C14-HSL结果尤为显著,提高了197.4%,表明冷冻刺激可促进荧光假单胞菌QS信号分子的产生。以上实验结果表明,荧光假单胞菌经冷冻胁迫一定天数后在适温恢复过程中致腐性和致病性均有增强,为进一步相关机制的研究及以相关蛋白为靶标进行低温抗菌剂的筛选奠定了基础。
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